截至年3月17日统计，COVID-19全球大流行已造成超过1.2亿人感染和万人死亡。据报道，随着疾病严重程度增加，淋巴细胞干扰素(IFN)-γ减少。在重症患者中，可以观察到IFNα水平低，浆细胞样树突细胞(DC)减少，紧急和失调的骨髓细胞生成，以及活化巨核细胞的扩大，而危重患者中存在增殖的浆母细胞和滤泡外B细胞活化，但尽管存在高水平的SARS-CoV-2特异性抗体和抗体分泌细胞，许多重症和重危患者并未康复。
年5月，英国剑桥大学、纽卡斯尔大学和伦敦大学学院等多个研究单位的研究人员在《Naturemedicine》发表了标题为“Single-cellmulti-omicsanalysisoftheimmuneresponseinCOVID-19”的研究。该研究对来自名不同严重程度COVID-19患者的的,多个外周血单核细胞进行了单细胞转录组、表面蛋白质组和T和B淋巴细胞抗原受体分析，研究结果强调了促成COVID-19发病机制的协调免疫反应，并揭示了可作为治疗目标的离散细胞成分。
改变了COVID-19严重性的免疫因子
研究人员对无症状、轻度、中度、重度和危重COVID-19患者的外周血单个核细胞(PBMC)的单细胞联合转录组和表面蛋白质组数据进行了基因评级（图1a)。对照组包括健康志愿者、患有非新冠的严重呼吸系统疾病患者和接受静脉注射脂多糖（IV-LPS）作为急性全身炎症反应替代物的健康志愿者(图1a)。对个样本中的1,,个细胞进行了测序。在去除计算偶极子后，,个细胞通过了质量控制(QC；每个细胞最低个基因和10%的线粒体读数)。使用Harmony17整合数据，通过k-最近邻批效应检测（kBET）的统计量来整合细胞的良好混合。在Leiden聚类之后，基于已知标记基因的RNA表达，对细胞进行手动注释，定义了18个细胞子集(图2，1b)，聚类之后确定了另外27个细胞状态(图1b、2a、3a、b和4a、b)。结果发现随着疾病的加重，增殖的淋巴细胞、增殖的单核细胞、血小板和动员造血干/祖细胞(HSPC)相对扩张，伴随着疾病的恶化。浆母细胞和B细胞在严重和危重的情况下扩增(图1c)。泊松线性混合模型表明，PBMC的组成随症状持续时间的不同而异。
研究人员发现I/III型干扰素反应基因在新冠肺炎严重程度不同的单核细胞、DC和HSPC中的表达（图2，1d)。与健康对照组相比，新冠肺炎患者的IFNAR2在大多数循环细胞类型中均上调，并且在浆母细胞、单核细胞和DC中高表达。对血清中45种蛋白的多重分析显示，轻/中度和重度/危重患者之间存在两种截然不同的特征。CCl4、CxCl10、白细胞介素(IL)-7和IL-1α与严重危重疾病相关。使用Cydar20通过将细胞划分为表型超球体，通过量化超球体内每个严重程度组的细胞数量，最终确定了个随着严重程度的增加在丰度上有显著差异的超球体(图1e)。研究人员发现，在所有主要免疫成分中均存在不同程度丰富的超球，并且B细胞(CD19+/CD20+)、浆细胞(CD38+)和祖细胞(CD34+)增加，以及骨髓腔室的重塑(图1e)。
转录组和蛋白组分析
单核巨噬细胞和HSPC改变。对血液单核巨噬细胞(MPs)的转录组和表面蛋白质组分析确定了已知的DC亚群(PDC、ASDC(Ax1+SIGLEC6+DC)、DC1、DC2和DC3)和几种单核细胞状态(图2a，b)。除了两种CD16+单核细胞状态(非经典CD16+和C1QA/B/C+CD16+)外（图2A，b)，还存在三种CD14+单核细胞状态(增殖中的、经典的CD14+和激活的CD83+)。增殖的单核细胞和表达MKI67和TOP2A的DC随着疾病严重程度的增加而增加(图2a、b)。相反，DC2和DC3的频率降低。巨噬细胞包含一群成熟的迁移性DC，它们表达CCR7和LAMP3，但下调DC特异性标记，如CD1C和CLEC9A。这些迁移性DC在健康状态下表达IL10，但在COVID-19中表达TNF和常见的IL-12和IL-23亚基IL12B，表明T细胞极化能力改变(图2e)。在外周血中，C1QA/B/C+CD16+单核细胞比所有髓系细胞表达更多的1型IFN反应基因(图2f)。SIRPA:CD47、FPR1:ANXA1、FPR2:APP在单核细胞:血小板之间的表达水平在C1QA/B/C+CD16+单核细胞中最高(图2g)。利用蛋白质数据，发现血小板上ICAM1与CD11a/b/c/CD18的相互作用主要在C1QA/B/C+CD16+单核细胞和CD16+单核细胞上，同时伴随着表明血小板活化的表面蛋白表达的增加(图2h)。
在,个PBMC的大型数据集中调查了个CD34+HSPC。通过Leiden聚类和统一流形逼近与投影(UMAP)可视化分析，研究人员注释出六个转录簇，即CD34+CD38-HSPC，CD34+CD38+早期HSPC和CD34+CD38+红系、巨核细胞和髓系HSPC，以及通过细胞周期（S期）基因表达区分的小群体(图2i)。巨核系祖细胞在健康和无症状感染者中缺失，但在所有有症状的患者中占CD34+细胞的5%左右（图2j)。由于外周血不是造血的场所，这一发现很可能反映了新冠肺炎介导的对正常骨髓HSPC平衡的干扰。
T淋巴细胞和T细胞受体改变基因图谱的精细分辨聚类显示了11个初始的CD4+T细胞，CD8+T细胞和先天类T细胞，包括γδT细胞、自然杀伤（NKT）细胞和粘膜相关恒定T（MAIT）细胞(图3a)。
T细胞室的细胞组成在健康组和感染组之间不同(图3d)。根据它们的相对比例和差异丰度检测(FDR10%)，发现活化的CD4+T细胞表达循环中的卵泡辅助因子IL22，循环卵泡助手T（TFH），1型辅助T(TH1)细胞、CD8+效应记忆T(TEM)细胞和MAIT细胞在无症状和轻度感染的个体中相对丰富，在感染较严重的个体中，NKT、增殖的CD8+和CD4+以及CD8+终末效应T(TTE)细胞相对丰富(图3e)。将疾病严重程度作为序数变量，多个细胞群体在疾病严重程度(增殖的CD4+和CD8+T细胞、CD8+TE、CD4+TH1、CD4+TH17、CD4+中枢记忆T细胞和IL-22+CD4+T细胞)上表现出非线性差异，说明了新冠肺炎引起的外周T细胞复杂的成分变化(图3e)。与疾病严重程度相反，CD4+TH1、CD4+TH2、CD4+IL-22+和CD4+TCM细胞在症状持续时间较长的个体中富集，而具有细胞*表型(CD8+TTE、CD8+TEM、MAIT和NKT细胞)的效应细胞在症状持续时间较短的个体中富集。
基因表达差异分析和基因集富集分析(GSEA)确定了与炎症和T细胞激活相关的多个亚群的通路，包括IL-2-STAT5信号、mTORC1信号、炎症反应、干扰素γ反应和IL-6-JAK-STAT3信号。T细胞克隆性分析表明，效应型CD8+T细胞克隆性最强（图3f、g)。相反，在病情较重的个体中，克隆性扩增记忆效应CD8+TEM细胞的相对比例降低（图3f，g)。CD8+T细胞与CD8+TEM细胞的比值(TE：EM)与病情严重程度相关（图3g)，这表明CD8+T细胞分化的结果可能有助于抗病*保护和免疫病理。
受体分析
B淋巴细胞和B细胞受体改变。B细胞和浆细胞重新聚类确定了九个簇（图4a，b）。其中，包括未成熟的、原始的、转换的和非转换的记忆B细胞，以及一组富含衰竭记忆B细胞中标记物的细胞（图4a）。研究人员还发现了大量CD19和CD20阴性表达的浆母细胞，以及增殖标记物MKI67的高表达（图4a、b）。在有症状的COVID-19个体中，浆母细胞和浆细胞显着扩增（图4c）。这种扩张的幅度从轻度到中度疾病增加，但在严重到危重疾病中减弱。由于IgA2亚类显着减少（图4d），有症状的COVID-19个体的IgA+细胞减少，这表明在无症状个体中维持有效的粘膜体液反应。同时，观察到无症状个体中循环滤泡辅助性T(cTFH)细胞的扩增最大，无症状/轻度疾病个体中的浆细胞随着疾病严重程度的增加而丢失（图3e）。总之，这表明在无症状和轻症中存在协调的T细胞和B细胞反应，产生有效的抗病*体液免疫，在严重和危重患者中则没有。
GSEA分析确定了在COVID-19患者所有B细胞亚群中富集的干扰素α反应和干扰素γ反应通路基因，这在无症状或轻症患者中更为明显，在重症和危重症患者中减弱（图4f）。B细胞中1型干扰素转录反应的大小反映了血清IFNα水平，该水平在轻度疾病个体中最高，表明在严重或危重患者中B细胞中IFN反应基因的低表达，这可能是因为严重或危重患者的初始抗病*反应减弱，或是个体在症状出现后无法维持骨髓细胞和pDC产生足够的IFNα。
在无症状个体中，通过核因子kappaB(NF-κB)通路基因的TNF信号在未成熟、初始和转换记忆B细胞中富集，但在重症和重危患者中未成熟B细胞和浆细胞中减少（图4f）。对该通路中前沿基因的评估表明，与有症状的个体相比，它们在COVID-19无症状个体的所有B细胞和浆母细胞/细胞亚群中的表达显着性更高（图4g）。
缺氧途径基因仅在无症状个体的未成熟和初始B细胞中富集（图4f）。由于这些个体不太可能缺氧（因为他们没有症状），分析表明，无症状COVID-19患者和轻度疾病患者的B细胞对干扰素有更明显的反应，NF-κB激活增加，与B细胞受体(BCR)交联激活信号相关的基因表达更高。这可能是由于BCR激活后，B细胞分化为产生抗体的浆细胞，伴随着氧化代谢的逐渐增加。研究观察到新冠严重程度类别之间的浆母细胞和浆细胞中代谢基因通路表达的差异，与有症状患者相比，无症状患者浆母细胞中糖酵解通路基因的相对增加（图4f）。
接下来使用“dandelion”（一种单细胞BCR测序分析包）评估了BCR克隆性，并发现COVID-19有症状个体的克隆扩增更显著。在所有主要细胞类型中都发现了扩增的克隆型，较大的克隆型主要存在于浆母细胞/浆细胞簇中。在扩展的克隆型中，有一些证据表明有症状的COVID-19组内发生了类别转换，但在无症状/健康个体中则没有。与其他使用BCR分析的大规模单细胞RNA测序(scRNA-seq)研究不同，免疫球蛋白重链可变(IGHV)基因的使用通常没有明显的偏差。将IGHV基因使用数据分解到各个性别组显示，与健康对照相比，患有严重COVID-19的女性中只有IGHV1-46显着增加。一些相关的BCR存在于不同的个体中，V和J基因使用以及重链和轻链CDR3相关氨基酸序列的发生率在患有严重或危重症的个体以及来自某个区域的个体中发生率更高（图4i)，这可能是由于病*的局部变异导致特定B细胞克隆的扩增。最后，观察到克隆型大小的不成比例分布，以及COVID-19患者BCR突变增加，与男性相比，女性的表现更明显（图4j）。B细胞克隆扩增的这些差异可能与男性新冠患者预后较差有关（图5）。
结语
首先，该研究表明，PBMC的组成随症状持续时间的不同会有差异。其次，在无症状患者中存在协调有效的T细胞和B细胞病*体液免疫，而重症和重危患者中则没有最后，性别组之间BCR克隆性和突变频率存在差异，这可能与导致男女不同预后结果有关。总之，通过多组学的研究分析了不同患病程度新冠患者体液中免疫因子组成的差异，揭示了可作为治疗目标的离散细胞成分。
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