背景
溃疡性结肠炎患者胃肠道粘液中的主要膜脂质磷脂酰胆碱（PC）浓度较低，表明结肠PC代谢缺陷可能与结肠炎的发展有关。为了确定PC在结肠屏障功能中的确切作用，作者对肠上皮细胞中PC合成的主要限速酶（CTPQ6：磷酸胆碱胞苷转移酶-α）缺失的小鼠的患结肠炎情况进行了考察
正文
01
CTαIKO小鼠的结肠磷脂浓度发生改变
作者用他莫昔芬诱导Cre重组酶得到成年CTαIKO小鼠。接着从mRNA和蛋白水平考察了CTα的表达情况，CTαIKO小鼠结肠中的表达水平明显低于对照组（60%和75%）。在诱导期，CTαIKO小鼠的体重显著降低，停止诱导后体重回升。此外，CTαIKO小鼠的结肠上皮细胞中PC含量显著低于对照组，而PE水平没有显著差异。这导致了CTαIKO小鼠结肠的PC/PE比例低于对照组。即使在7周之后，这些现象仍然存在。
Figure.1
A.他莫昔芬处理结束7天后，对照组和CTαIKO小鼠结肠组织中Pcyt1a的mRNA丰度。B,C.他莫昔芬处理结束7天后，从对照小鼠和CTαIKO小鼠中分离出的结肠上皮细胞中的CTα蛋白WB和相对定量。D.他莫昔芬处理后7天的体重变化情况。E.他莫昔芬处理结束7天后，CTαIKO小鼠和对照组小鼠结肠组织中的PC和PE含量。F.他莫昔芬处理结束7天后，CTαIKO小鼠和对照组小鼠结肠组织中PC和PE的比例。G-L.他莫昔芬处理后7周，以上指标与7天组趋势一致。
02
CTαIKO小鼠自发产生结肠炎
诱导后7天，CTαIKO小鼠结肠重量比对照组升高50%，血细胞数量、血红蛋白和血细胞比容都明显低于对照组，说明可能是肠道损伤造成了贫血。此外，CTαIKO小鼠的抑菌蛋白脂质运载蛋白2含量都明显高于对照组，同时伴有隐窝脓肿、淋巴细胞浸润固有层、隐窝发育不良。HE染色之后的病理学评分显示，诱导后第四天，CTαIKO小鼠就已经产生了自发性结肠炎。从病理学评分和杯状细胞消耗来看，膳食PC补充剂无法影响体重减轻和疾病进程。与远端结肠相比，CTαIKO小鼠的近端肠黏膜固有层的肠细胞损伤，上皮增生和淋巴细胞浸润的水平相似，且盲肠的病理学评分也比对照组高。即使在CTαIKO小鼠体重回升至与对照组一致时，结肠病理学评分也没有明显改善。而7周后，免疫细胞浸润、隐窝脓肿、和杯状细胞消耗都得到了显著改善。与之相一致，杯状细胞标记物Muc2、Tff3的转录无显著差异。而内质网压力标记物Atf5转录明显增加。
Figure.2
A.诱导后7天CTαIKO小鼠和对照组的结肠重量。B.诱导后第4天CTαIKO小鼠和对照组的血浆载脂蛋白2浓度。C,D.诱导4天后对照组和CTαIKO小鼠的远端结肠切片HE染色。E-H.对照组、CTαIKO隐窝脓肿、CTαIKO淋巴细胞浸润、CTαIKO隐窝发育不良。I.对照组和CTαIKO小鼠结肠HE染色病理学评分。
Figure.3
A.诱导后对照组和CTαIKO小鼠及对应的PC补充组的体重变化情况。B.诱导后对照组和CTαIKO小鼠及对应的PC补充组的肠道病变情况。C,近端结肠、远端结肠和盲肠的上皮损伤病理学评分。D.诱导后7周的病理学评分。
Figure.4
A.诱导后4天对照组和CTαIKO小鼠结肠HE染色。B.诱导后4天对照组和CTαIKO小鼠盲肠HE染色。C,对照组和CTαIKO小鼠及对应的PC补充组的肠道病理学评分。D.两种饮食方式的杯状细胞消耗评分。E.诱导后7周与4天的结肠HE染色。F.杯状细胞标记物和内质网压力标记物基因转录情况。
03
CTαIKO小鼠杯状细胞粘液颗粒丢失和黏液囊超微结构损伤
诱导后第4天，阿辛蓝染色显示CTαIKO小鼠结肠杯状细胞减少。电镜观察发现，CTαIKO小鼠的杯状细胞中含黏液囊泡的超微结构完整性受损，黏液颗粒丢失和细胞碎片浸润。这导致了CTαIKO小鼠的杯状细胞评分显著高于对照组小鼠。同时，CTαIKO小鼠结肠杯状细胞Muc2和Tff3表达明显低于对照组，而Agr2的表达并没有差异。此外，三种肠分泌细胞标记物中只有Neurog3表达有差异。这说明杯状细胞可能对CTα缺失敏感，而CTαIKO小鼠结肠中与杯状细胞成熟相关的基因转录减少证实了这一点。
Figure.5
A.对照小鼠和CTαIKO小鼠结肠的代表性阿辛蓝/高碘酸-Schiff染色。B.对照小鼠和CTαIKO小鼠的结肠杯状细胞黏液囊电镜照片。C.对照小鼠和CTαIKO小鼠的杯状细胞丢失评分。D.对照小鼠和CTαIKO小鼠结肠黏液层相关基因转录情况。E.对照小鼠和CTαIKO小鼠肠分泌细胞相关基因转录情况。F.对照小鼠和CTαIKO小鼠杯状细胞成熟相关基因转录情况。
04
CTαIKO小鼠的粘液层变薄且肠通透性增强
CTαIKO小鼠的粘液层比对照组薄，且电镜观察发现结肠上皮细胞顶刷缘受到广泛破坏，肠道通透性也显著增加。因此，作者考察了紧密连接蛋白表达情况，发现Cldn2显著降低，Cldn4显著升高。此外，作者还考察了细胞焦亡（Casp4、Gsdmd）和胞质细菌DNA检测蛋白（Zbp1）的表达情况，发现CTαIKO小鼠的这三个基因转录水平显著高于对照组。肠道常到通透性增加后，发生了微生物浸润的现象。
Figure.6
A.对照小鼠和CTαIKO小鼠的黏液层阿辛蓝染色。B.对照小鼠和CTαIKO小鼠的肠上皮细胞顶刷缘电镜照片。C.FITC测定肠道通透性。D.对照小鼠和CTαIKO小鼠的结肠紧密连接蛋白、细胞焦亡和胞质细菌DNA检测蛋白基因的转录情况。
05
肠上皮细胞中PC的耗尽导致内质网应激和蛋白反应激活
电镜下观察CTαIKO小鼠的结肠上皮细胞，发现内质网发生扩张和膨胀。由于内质网脂质成分改变能够激活未折叠蛋白反应（UPR），进而导致磷脂双分子层应激，所以作者考察了UPR诱发基因IRE1α的下游靶基因XBP1、内质网应激传感器蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）和活化转录因子6（ATF6）的的表达情况。结果显示，CTαIKO小鼠结肠中的XBP1、PERK、P62和ATF6都显著上调，Ddit3,Atf4,Atf5,和Eif4ebp1的mRNA水平也显著升高。此外，还观察到结肠上皮细胞中包含大量自噬小泡。这些结果可以说明，对膜磷脂成分的扰动导致内质网应激和CTαIKO小鼠肠上皮细胞的UPR激活。接着，作者尝试用PBA缓解内质网应激，但从病理学评分、杯状细胞耗竭和生物标记物来看，PBA没有发挥预想中的作用。但PBA抑制了CTαIKO小鼠结肠重量增加、IL-1β和MCP-1表达。这些结果说明，PBA钝化了IL-1β和MCP-1的诱导作用，从而加剧了肠上皮细胞磷脂成分扰动导致的炎症。
Figure.7
A.对照组和CTαIKO小鼠的结肠上皮细胞电镜照片，箭头指向内质网。B.对照组和CTαIKO小鼠结肠上皮细胞中sXBP1、Ddit3和Hspa5的表达。C-D.对照组和CTαIKO小鼠结肠中sXBP1、PERK和ATF6的WB和相对定量。E.对照组和CTαIKO小鼠结肠中Atf4,Atf5,和Eif4ebp1的转录水平。F-G.对照组和CTαIKO小鼠结肠中P62的WB和相对定量。H.对照组和CTαIKO小鼠结肠上皮细胞中自噬囊泡的电镜照片。I-L.有无PBA处理的对照组和CTαIKO小鼠结肠病理学评分、杯状细胞消耗评分、sXBP1、Ddit3和Hspa5的转录水平和结肠重量。
06
膜脂质成分变化引起的内质网应激驱动肠上皮细胞坏死
TUNEL染色能够检测细胞凋亡、坏死或焦亡产生的DNA片段，从而呈现阳性。通过TUNEL染色可以看出，CTαIKO小鼠结肠病变更加严重，这些病变主要集中在杯状细胞丰富的结肠隐窝，所以作者研究了导致TUNEL染色阳性的原因。作者发现CTαIKO小鼠结肠中剪切caspase-3和caspase-8的蛋白水平低于对照组，且抗凋亡因子Birc5和Ccnd1的转录水平高于对照组。说明凋亡不是导致TUNEL染色阳性的主要原因。
接着，作者对细胞坏死进行了考察。在电镜照片下发现CTαIKO小鼠结肠上皮细胞出现线粒体和内质网肿胀、质膜破裂和胞质空泡的症状，且细胞坏死调节因子RIP3的mRNA和蛋白水平显著升高。综上所述，结肠上皮细胞中磷脂失衡会引起内质网应激反应，从而导致细胞坏死、屏障功能丧失、微生物浸润和自发性结肠炎。
Figure.8
A-C.对照组和CTαIKO小鼠的结肠TUNEL染色。D-E.对照组和CTαIKO小鼠的结肠中裂解caspase-3的WB和相对定量。F-G.对照组和CTαIKO小鼠的结肠中裂解caspase-8的WB和相对定量。H.对照组和CTαIKO小鼠的结肠中Birc5和Ccnd1的丰度。I.CTαIKO小鼠结肠细胞坏死特征的电镜照片。J-K.对照组和CTαIKO小鼠的结肠中RIP3的WB和相对定量。L.对照组和CTαIKO小鼠的结肠中Rikp1和Ripk3的丰度。
结论
使用肠道从头合成PC受损的小鼠，作者发现维持肠道上皮细胞膜的PC含量对于预防内质网应激和结肠炎发展至关重要。保持肠上皮细胞膜的PC含量可防止小鼠结肠炎的发展，说明在结肠内稳态中磷脂成分起到了关键作用。
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