原文出处：LiD,FengY,TianM,JiJ,HuX,ChenF.Gutmicrobiota-derivedinosinefromdietarybarleyleafsupplementationattenuatescolitisthroughPPARγsignalingactivation.Microbiome.Apr5;9(1):83.
研究背景：
炎性肠病（Inflammatoryboweldisease，IBD）包括溃疡性结肠炎（Ulcerativecolitis，UC）和克罗恩病（Crohn’sdisease，CD），是一种肠道慢性炎症性疾病。UC发病特点是不连续病变，主要累及盲肠和结肠的黏液层，已有报道指出其主要受遗传和环境因素影响，但具体发病机制尚不完全清楚。研究显示，UC患者结肠上皮中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ，PPARγ）表达降低，可能是导致肠道功能障碍和慢性炎症的重要因素。临床上，PPARγ是5-氨基水杨酸和皮质类固醇等抗炎药的重要靶点，但目前大多数药物干预缺乏特异性，可能会产生不良影响，因此迫切需要寻找能够预防和治疗结肠炎的新的治疗策略。
人体肠道内约含有数百万亿的细菌，对人体生理功能具有重要因素。有研究表明，将肠易激综合征患者粪菌移植到无菌小鼠体内，可导致小鼠肠道运动功能和屏障功能障碍。因此，肠道菌群可能是维持肠道稳态的关键介质，靶向特定微生物对结肠炎的发生发展可能具有预防和治疗作用。另有研究证实，肠道菌群对宿主生理功能的影响主要依赖于宿主和菌群共同代谢产生的小分子物质，如短链脂肪酸、胆汁酸和吲哚衍生物等。肌苷是腺苷的主要代谢产物，是细胞内重要的嘌呤核苷，作为腺苷受体的功能激动剂，参与许多生理过程。肌苷同时也是肠道菌群的重要代谢产物，有研究表明，肠道菌群产生的肌苷可以通过激活抗肿瘤T细胞来增加免疫检查点阻断的效果。
大麦叶（Barleyleaf，BL）是大麦的幼苗，具有抗氧化特性，作为传统中药对肠道具有潜在的促进作用。然而肠道菌群的代谢物在BL对肠道功能的有益作用中是否发挥作用尚不清楚。作者应用小鼠结肠炎模型，证实了BL可以显著减轻病情以及菌群失调，并揭示BL可能通过激活PPARγ改善粘膜屏障功能。抗生素处理进一步阐明肠道菌群参与了BL诱导的结肠组织代谢重编程。此外，作者确定BL对结肠炎的有益作用是通过菌群代谢产物肌苷与腺苷2A受体（adenosine2Areceptor，A2AR）/PPARγ信号通路作用实现。因此，本研究为BL在结肠炎保护作用中的潜在机制提供了新视角，并揭示了BL和肌苷在预防溃疡性结肠炎中的潜在应用。
研究结果
结果一：BL可改善结肠炎症状和肠道菌群失调
作者使用葡聚糖硫酸钠（dextransodiumsulfate，DSS）诱导结肠炎小鼠模型，如图1.A所示，对照组给予标准饮食（Chowdiet，CD），模型组给予BL饮食。与对照组相比，BL组小鼠可以显著缓解DSS诱导结肠炎组小鼠的体重减轻、疾病活动指数（DAI）评分降低、结肠缩短以及肠道通透性的增加（图1.B-E）。为验证BL是否可以改善DSS诱导的肠道菌群失调，作者对结肠内容物进行16SrRNA测序，结果显示BL+DSS组与BL组和CD组无显著差异，而CD+DSS组与其它三组相比差异显著，表明BL可以逆转DSS处理导致的菌群失调（图1.F）。Chao指数和Shannon指数α多样性分析结果表明，结肠炎小鼠模型中与CD组相比，BL处理可以显著增加结肠中菌群丰度以及菌群的多样性（图1.G）。接下来，作者进一步在门水平和科水平上检测菌群的变化，结果显示，BL可以显著减少DSS诱导所致的变形菌门以及肠杆菌科的增加（图1.H和I）。以上结果表明，膳食补充BL可以预防DSS诱导的结肠炎和肠道菌群失调。
图1
结果二：BL可以增强结肠蠕动并且改善屏障功能
作者认为BL饲养对结肠炎的保护作用可能是通过在造模前改善肠道功能来实现的。肠道形态学研究表明，与对照组小鼠相比，BL饲养组小鼠结肠中隐窝高度和肌肉层宽度明显增加（图2.A-C）。由于BL饲养组小鼠结肠肌肉层宽度明显增加，作者推测BL饲养是否会对肠道运动产生影响。结果显示，与对照组小鼠相比，BL饲养组小鼠排便频率增加、肠道转运时间缩短（图2.D和E）。扫描电镜结果显示，BL饲养组小鼠肠道形态学发生明显改变，结肠表面有明显的棱角（图2.F），表明BL可能通过改善肠道屏障功能对结肠炎起到保护作用。
接下来为深入探究BL对粘膜屏障功能的影响，作者将研究聚焦于结肠黏液层。阿利新蓝染色结果显示，与对照组小鼠相比，BL饲养组小鼠结肠中产生黏液的杯状细胞数量显著增加，并且杯状细胞中黏蛋白颗粒在粘膜表面呈现增强的顶端胞吐和分泌作用（图2.G）。Muc2是黏液层中最丰富的粘蛋白，免疫组化结果显示，与对照组小鼠相比，BL饲养组小鼠结肠中Muc2阳性的杯状细胞显著增加（图2.H）。透射电镜结果显示，BL饲养组小鼠结肠杯状细胞膜上含有较大的黏蛋白颗粒，表明结肠杯状细胞中黏蛋白的产生和积累显著增加。以上结果表明，BL可能通过促进结肠运动和增强粘膜屏障来改善肠道功能。
图2结果三：BL可改变肠道基因表达谱并激活PPARγ信号通路
为进一步阐明BL饲养对小鼠肠道运动和粘膜屏障的保护机制，作者对结肠组织进行转录组分析，结果显示，BL饲养组与对照组相比结肠中有个基因上调，个基因下调（图3.A）。KEGG富集分析显示，与对照组相比，BL饲养组小鼠中差异最显著的信号途径为PPARγ（图3.B）。有趣的是，26个显著改变的基因均参与PPAR信号通路并且参与营养代谢，如脂质生物合成（Scd1）、脂质降解（Lpl、Adipoq）、脂质储存（Plin1、Plin2、Plin4）、脂质转运（Scp2、Slc27a1、Slc27a2）、脂质结合（Fabp4、Fabp5、CD36、Ppara、Pparg）、β-氧化（Cpt1a、Acsl1、Acsl3、Ehhadh）和胆固醇代谢（Hmgcs1、Hmgcs2、Cyp27a1）（图3.C）。结果表明，脂质代谢与黏膜屏障功能密切相关。STRING分析显示出变化显著的基因的相互作用网络（图3.D）。实时定量PCR检测PPAR信号通路中关键mRNA的表达水平，结果显示，与对照组相比，BL饲养组小鼠的Pparg基因表达显著增加（图3.E）。免疫荧光结果进一步证实BL饲养组小鼠结肠组织中PPARγ蛋白表达增加（图3.F）。以上结果表明，BL饲养可能通过改变营养代谢相关基因，激活PPARγ信号通路发挥发挥肠道保护作用。
图3
PPARγ信号通路在调节肠道稳态中具有重要作用。为了验证PPARγ信号通路是否能够改善肠道功能，作者使用PPARγ信号抑制剂GW对小鼠进行口服给药，与前文一致，与对照组相比，BL饲养组小鼠结肠隐窝高度和肌肉层宽度显著增加（图4.A-C）并且排便频率增加、肠道转运时间缩短（图4.D和E），然而，对小鼠给予GW处理后，以上作用均被消除。GW处理后消除了BL对黏膜屏障功能的保护作用，小鼠结肠中的杯状细胞数量与对照组相比无显著差异。为了验证BL是否通过激活PPARγ对结肠炎发挥保护作用，作者检测结肠炎小鼠发病情况。结果显示，与对照组相比，BL饲养可以显著缓解结肠炎小鼠体重减轻、DAI评分降低、肠道通透性增加以及结肠缩短，而GW处理，可以显著消除BL对DSS诱导的结肠炎的保护作用（图4.G-I）。以上表明，BL可能通过激活PPARγ信号通路来预防DSS诱导的结肠炎。
图4结果四：BL可以促进肠道菌群代谢产物嘌呤的富集
调节饮食可以影响微生物的代谢组成，而代谢产物则是宿主与微生物相互作用的关键介质。因此作者猜想，BL是通过菌群代谢产物对肠道发挥保护作用的。为验证此猜想，作者对小鼠结肠内容物以及血清进行非靶向代谢组学检测，结果显示，两组小鼠间聚类分离显著（图5.A和B）。热图分析结果显示，与对照组相比，BL饲养组小鼠代谢产物发生显著改变，其中小鼠结肠内容物中有23种代谢产物改变（16种上调、7种下调），血清中有28种代谢产物改变（14种上调、14种下调）（图5.C和D）。代谢组学图谱显示，BL饲养后葡萄糖、脂质以及氨基酸代谢明显改变，确切的说嘌呤代谢的主要代谢产物肌苷和鸟苷在BL饲养的小鼠中显著增加（图5.E和F）。作者进一步推测，BL饲养小鼠可能通过改变肠道菌群增加肌苷和鸟苷的水平。作者对两组小鼠给予抗生素处理，靶向检测两组小鼠代谢产物中肌苷与鸟苷的水平。结果显示，与对照组相比，BL饲养的小鼠结肠内容物与血清中肌苷和鸟苷的水平显著增加，而抗生素处理抑制了肌苷和鸟苷的增加（图5.G和H）。
图5
为了验证肠道菌群在BL介导的嘌呤代谢物富集中的作用，作者在无氧条件下将BL与新鲜小鼠粪便共同孵育，检测发酵后肌苷和鸟苷的浓度（补充图1.A）。结果显示，与对照组相比，BL组发酵产物中肌苷和鸟苷的水平显著增加（补充图1.B和C）。为了确定是何种原因导致肌苷与鸟苷的积累，作者对发酵的产物进行16sRNA测序，分析孵育12小时与孵育24小时的产物中细菌组成比例。结果显示，对照组与BL处理12小时、24小时组的发酵产物相比聚类分离显著（补充图1.D）。并且发现，与对照组相比，BL处理组的菌群α多样性降低（补充图1.E和F）。门水平分析结果显示，与对照组相比，BL孵育组中厚壁菌门的相对丰度显著增加，拟杆菌门的丰度显著降低（补充图1.G和H）。值得注意的是，BL发酵组乳酸杆菌的含量12小时与24小时分别增加了63倍与90倍（补充图1.I和J）。Pearson相关分析表明乳酸杆菌丰度与肌苷和鸟苷的含量呈正相关（补充图1.K和L）。以上结果表明，BL孵育产物中乳酸杆菌的增加与肌苷和鸟苷的富集相关。
补充图1
结果五：肌苷可激活人结肠上皮细胞中PPARγ信号
由于菌群代谢产物与肠道上皮接触密切，作者认为代谢产物可能与肠道上皮细胞具有直接作用。为了验证这一猜想，作者在体外评估了肌苷和鸟苷的功能活性，结果如图6.A和B所示，不同浓度的肌苷与鸟苷，对人的结肠上皮细胞（HT-29）均未表现出明显的*性。接下来作者检测了肌苷和鸟苷对PPARγ信号的生物活性影响，结果发现应用肌苷处理的细胞中PPARγ荧光素酶活性显著增加，而鸟苷处理的细胞中没有显著变化（图6.C和D）。表明肌苷可能是BL诱导PPARγ信号激活的关键产物。作者还在HT-29和Caco2细胞系中检测到肌苷处理后，PPARγ信号通路中的关键基因，如脂质降解基因Lpl、脂质生物合成基因Scd1、脂质结合基因CD36、Fabp4、脂质转运基因Slc27a1和β-氧化基因Cpt1a表达显著增加（图6.E和F）。Westernblot与免疫荧光结果进一步证实了PPARγ蛋白水平升高（图6.G-I）。为了进一步验证肌苷诱导黏蛋白的产生是否通过PPARγ介导，作者使用siRNA抑制PPARγ的表达，居于肌苷处理，结果发现，肌苷处理组Muc2的表达显著增加，而在PPARγ敲低的细胞中，肌苷未能诱导Muc2表达变化（图6.J和K）。已有报道显示，肌苷是A2AR的配体，作者检测了肌苷能否通过A2AR介导PPARγ信号的激活，结果显示，肌苷未能增加A2AR敲低细胞中PPARγ和Muc2的表达（图6.I和M）。以上结果表明，肌苷部分通过A2AR/PPARγ途径诱导黏蛋白的表达。
图6
结果六：肌苷可通过A2AR/PPARγ信号改善肠道功能并预防结肠炎
接下来作者在体内验证，A2AR/PPARγ信号可介导肌苷对肠道的保护作用（图7.A）。与体外实验结果相一致，肌苷处理使结肠组织中PPARγ及其靶基因（Lpl、Scd1、CD36和Fabp4）的表达显着增加（图7.B和C）。并且给予肌苷处理组与给予BL处理组小鼠肠道形态具有相似结果，即肌肉层宽度明显增加（图7.D和E）。肌苷还可以增加小鼠的排便频率并减少肠道转运时间以增强肠道运动（图7.F和G）。此外实验结果还表明，肌苷处理可以通过增加产生黏液的杯状细胞数量来改善肠道黏膜屏障功能（图7.H）。然而，肌苷对使用GW或A2AR特异性拮抗剂SCH处理的小鼠无以上作用（图E-H）。接下来作者检测了肌苷能否减轻DSS诱导的结肠炎症状，结果显示，肌苷可以缓解DSS诱导结肠炎小鼠的体重减轻、DAI评分降低以及结肠缩短情况（图7.I-K）。此外，肌苷还可以改善DSS处理诱导小鼠的肠道通透性增加以及组织损伤（图7.L-N）。然而，当使用GW或SCH对小鼠进行处理时，肌苷对结肠炎的保护作用被逆转（图7.I-N）。因此，以上结果表明，肌苷部分通过A2AR/PPARγ信号通路对结肠炎发挥保护作用。
图7
研究结论：
1.大麦叶（BL）可改善结肠炎模型小鼠的结肠炎症和肠道菌群失调；
2.同时，代谢谱分析表明，在BL诱导的代谢重编程中，糖酵解通路富集；
3.BL促进肠道菌群（如乳酸杆菌）衍生物肌苷的富集，肌苷可通过PPARγ通路作用于结肠上皮细胞，进而对结肠起到保护作用；
4.外源性肌苷补充可通过PPARγ通路产生与BL类似的保护作用，而抑制PPARγ信号可消除BL的保护作用。
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇