导读
磷虾油（KO）是一种富含ω-3多不饱和脂肪酸的潜在抗氧化天然产物，多不饱和脂肪酸具有抗炎作用，但其在炎症缓解及粘膜愈合中扮演的角色尚未明确。近期在Microbiome上发表的一项题为“磷虾油在体外和体内模型中减轻肠道炎症与调节菌群的机制研究”的最新文章发现KO可通过抑制多个炎症信号通路在体外（THP1细胞系）抑制炎症因子表达并在体内（小鼠结肠炎模型、猪结肠炎模型）调节肠道菌群并缓解肠道炎症。在机制上KO可通过抑制组氨酸代谢以发挥其抗炎作用。
论文ID
题目：Mechanisticinsightsintotheattenuationofintestinalinflammationandmodulationofthegutmicrobiomebykrilloilusinginvitroandinvivomodels
译名：磷虾油在体外和体内模型中减轻肠道炎症与调节菌群的机制研究
期刊：Microbiome
IF：11.
发表时间：.6.4
通讯作者：RobertW.L
DOI号：10./s---8
主要内容
1KO通过调节相关信号通路减轻体外炎症
KO以剂量依赖性方式显著降低脂多糖（LPS）诱导的分化的THP1人巨噬细胞中IL1β和TNFα的mRNA表达（图1a和b），KO（μg/ml）孵育72h没有检测到细胞*性（图1c）。利用转录组测序研究KO与两个抗炎化合物—塞来昔布（COX2抑制剂，CX）和TPCA1（IKK2抑制剂）的协同作用，KO与CX或TPCA1联用比单独使用KO更好地降低促炎基因（IL6，NOD2和CCL2）的表达（图1b-g）。单独使用KO或与CX和TPCA1联用可抑制多个巨噬细胞LPS活化途径，Toll样受体和TNF信号通路显著富集（图1h）。多个与PPAR信号通路相关的基因经LPS处理显著下调，但单独使用KO或与CX和TPCA1联用可上调这些基因的表达（图1i）。
LPS还上调许多M1型巨噬细胞标志物基因（CCL2，IL12B，CXCL9，CXCL10，CXCL11和CD80），KO处理48h可以逆转这些促炎M1型基因的表达（图2）。KO还能够使LPS抑制的M2型巨噬细胞标志物基因表达恢复到正常水平（图2a-e），这些结果说明KO可能促进人巨噬细胞由M1型向M2型极化。KO还显著增加了巨噬细胞介导的胞内细菌杀伤作用，显示为经杀伤后存活的细菌细胞显著减少（图2f）。体外试验表明KO在炎症的初期和缓解前阶段均有调节作用，或许对促进黏膜愈合有效果。
图一：单独使用KO或与CX和TPCA1联用对LPS处理的人分化THP-1细胞促炎细胞因子和转录组的影响。
图二：KO增加巨噬细胞胞内细菌杀伤能力并调节体外巨噬细胞不同标记物的基因表达。
2KO减轻Th2驱动的猪结肠炎模型中肠道黏膜损伤
Th1/Th2/Th17失衡是结肠炎发病的重要驱动力，重新平衡Th1/Th2免疫应答可改善DSS诱导的结肠炎，体外试验发现KO抑制Th1免疫应答并出现促进M1/M2巨噬细胞极化的作用，接下来利用Th2诱导的猪结肠炎模型以观察KO的抗炎特性以及在促进炎症消退中的作用。HE染色结果表明KO处理28天可以改善猪毛尾线虫感染诱导的结肠病理性损伤（图3a），补充KO还能够部分逆转了感染导致的隐窝长度增加（图3b），改善了结肠平滑肌厚度和总组织病理学评分（图3c），显著增加了杯状细胞数量（图3d）。
图三：补充KO对猪结肠组织病理学评分的影响。
3KO部分恢复了猪毛尾线虫诱导的肠道微生物紊乱
猪毛尾线虫显著降低猪alpha多样性指数（图4a），KO处理显著增加了两个丰度指数（图4b），无论感染情况如何，KO处理后增加了Chao1指数和系统发育多样性，但是对物种均匀度（Shannon和Simpson指数）没有影响。但感染对肠道微生物的多样性产生了影响，导致OUT、系统发育多样性、Shannon和Simpson指数显著减少（图4a），并且感染对beta多样性也有显著影响（图4c）。排列多变量方差分析结果表明，肠道微生物组成的14.7%的变异可以解释为感染的影响，而KO只能解释2.4%的变异。感染与饮食补充之间没有显著的相互作用。基于NMDS分析（图4c和d）也支持以下假设：影响肠道微生物组成和结构的主要因素是感染状态。厚壁菌与拟杆菌比例（F/B）是感染诱导的微生物紊乱的标志之一，在添加KO的背景下，感染导致厚壁菌门的丰度显著下降，而拟杆菌的数量随之增加。但KO显著改善了与感染相关的F/B的降低（图4e）。
微生物组组成分析显示，补充KO后立克次体目未分类属的相对丰度显著降低（图5a）。在种水平上，在喂食KO的猪中阴道乳杆菌的丰度显著降低了约3倍（图5b）。此外，在26个OTU中，至少有三个OTU是在感染状态下与KO呈负相关的，被归入乳杆菌属（图5c）。随机森林（RF）选择的20个最重要的属提供了KO和豆油（SO）组之间的准确分类（图5d）。使用selbal可以准确预测出未感染组的微生物特征或平衡性。这种平衡由两个属组成，即考拉杆菌属和脱硫弧菌科中的一个未分类属作为分子，而费氏杆菌属作为分母，在感染状态的受试工作特征曲线下的面积为0.（图5e）。感染组的平衡值为负，表明分子中的两个属的丰度比分母费氏杆菌的丰度低得多。此外，由变形菌门中的两个属组成的平衡，包括分子立克次体中的未分类属和分母变形菌纲中的未分类属，对KO补充具有很高的预测准确性（图5f）。KO组的平衡比SO低得多，这表明KO降低立克次氏体中未分类属的相对丰度在模型性能中起重要作用，并且可能具有关键的功能相关性。在将感染视为协变量的同时又增加了一个新的平衡，即在最初的两个属中分别增加了两个属，即克罗诺杆菌和梭状芽胞杆菌作为分子和分母，从而提高了膳食补充剂的预测准确性。
图四：KO调节猪模型的肠道菌群。
图五：重要的微生物分类群与猪的感染和补充状况有关。
4KO通过抑制组氨酸代谢发挥其抗炎活性
从KO喂养猪的预测数据可以看出组氨酸代谢途径发生了改变，因此使用非靶向代谢组学分析来证实KO对组胺的抑制作用。如图6a所示，组氨酸分别被L-组氨酸脱羧酶（一种编码组氨酸代谢限速酶的基因）和组氨酸氨裂合酶降解为组胺和尿酸。给猪饲喂KO显著降低了感染引起的肠道组胺水平的升高。感染引起的肠腔组胺增加可能是由于宿主和微生物来源的组胺生物合成增强所致。与未感染的对照组相比，转录组分析检测到感染猪的近端结肠组织中L-组氨酸脱羧酶的mRNA水平增加，喂食KO后L-组氨酸脱羧酶的表达量显著降低（图6b）。偏最小二乘判别分析将葫芦巴碱，组胺和N-乙酰基组胺确定为在感染下将KO与SO区分开来的前3种代谢物（图6c）。RF表明在研究中不管感染状况如何，肠道组胺水平与微生物分类单元均具有很小的关联性。通过RF鉴定出的最高的组胺水平微生物预测指标包括乳酸杆菌，大肠埃希氏菌，韦永氏菌和梭状芽胞杆菌（图6d）。
使用Pearson相关分析研究网络模块特征关系，在用SO喂养的感染猪中，模块＃2与组胺和1-甲基组胺值均呈负相关，而模块＃4与组胺和1-甲基组胺值均呈负相关（图7a）。这两个模块的显著属性是大多数OTU都属于梭菌纲。从补充KO的感染猪推断出的网络中，模块＃13与1-甲基组胺呈负相关，该模块9个节点中的8个属于梭菌。这些结果表明梭状芽孢杆菌目物种之间的强烈微生物相互作用可能会降低肠道1-甲基组胺值。更有趣的是感染和KO补充网络中的模块＃14（图7b）与组胺和1-甲基组胺都有很强的正相关性，模块＃14中的所有OTU都属于乳杆菌属。这些发现表明在乳酸杆菌和梭状芽胞杆菌中使用益生元和益生菌促进微生物之间的强烈相互作用，可能对组氨酸代谢具有重要的调节作用。
图六：KO抑制猪组氨酸代谢。
图七：与猪模型中肠腔内组胺和1-甲基组胺浓度相关的网络模块。
5Th1依赖型结肠炎小鼠验证KO促解决特性及其对肠道菌群的调节作用
利用柠檬酸杆菌诱导C3H/HeNCr小鼠结肠炎模型验证乳酸菌相关物种在调节KO抗炎反应中的重要性。与猪毛尾线虫诱导Th2不同，柠檬酸杆菌诱导了独特的Th1/Th17免疫应答。柠檬酸杆菌感染的小鼠出现显著体重下降和脾脏指数增加（图8a和b），结肠长度和结肠指数也受到感染的显著影响。与感染组小鼠相比，饲喂KO可以部分地缓解体重减轻并改善脾脏指数，同时显著减少粘膜附着的柠檬酸杆菌的细菌载量（图8c）和由柠檬酸杆菌诱导的炎性浸润的数量（图8d），KO补充还导致由柠檬酸杆菌感染升高的促炎细胞因子（如TNF，IL1β，IL12，IL17A，IL22和CCL2）的表达水平显著降低（图8e）。非靶向代谢组分析确定，与健康小鼠相比结肠炎小鼠中至少有10种代谢物的水平显着降低，这些代谢物参与了四个促解析途径（阿司匹林引起的消退素E生物合成，阿司匹林引起的脂蛋白生物合成，白三烯生物合成和脂蛋白生物合成）。例如在结肠炎小鼠中消退素E1的肠腔内浓度比健康对照组低3.3倍，而脂蛋白A4和B4的水平低2.7倍。KO补充显著增加了至少三种参与促分解途径的代谢物，包括阿司匹林引起的消退素E和脂蛋白生物合成途径。这些发现为KO改善炎症的初始阶段和缓解阶段提供了进一步的支持。柠檬酸杆菌感染对肠道微生物组成有显著影响，与健康对照组相比结肠炎小鼠共有18个属的数量发生了变化（如结肠炎模型中萨特氏菌丰度显著增加了约倍）。微生物营养不良指数（MDI）定义为粪球菌属和拟杆菌属的总和与SMB53的总和的对数比，与健康对照组相比结肠炎小鼠的MDI明显更高，饲喂KO可显着降低小鼠的MDI（图8f）。KO还影响了18个被感染显著改变的属中的3个（SMB53，欧文氏菌和双歧杆菌）。KO将感染引起的显著增加的SMB53丰度逆转至基线水平。这三个属都是最重要的特征，有助于通过RF对PBS组中的KO进行分类（图8g）。RF和sPLA-DA算法都按此顺序将SMB53，欧文氏菌和双歧杆菌列为KO和PBS组之间的三个重要特征。KO对与乳杆菌有关的几个OTU的丰度也有重要影响，分配给乳杆菌的OTU的丰度从感染引起显著增加而反转为基线。至少三种细菌种类（产气荚膜杆菌，罗伊氏乳杆菌和阴道乳杆菌）具有相似的趋势（图8h）。乳杆菌和未分类的乳杆菌目下的乳杆菌属是通过RF进行KO分类的重要特征之一（图8g）。
图八：补充KO减轻了柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠炎。
6对小鼠结肠炎相关病理生理特征具有较高预测准确性的微生物特征
柠檬酸杆菌感染和补充KO对结肠的一些病理生理参数有显著影响，如结肠长度、结肠指数、脾脏指数和每克结肠组织柠檬酸杆菌数量。由分子SMB53和分母拟杆菌组成的全局平衡可以准确预测PBS对照组的KO补充量（图9v）。平衡值为负表明SMB53的相对丰度比拟杆菌更低。较低的平衡值表明KO补充与SMB53丰度的显着降低和拟杆菌的丰度增加有关。由拟杆菌和特布尔西菌组成的微生物特征对感染和未感染小鼠的微生物群落进行了高精度分类（图9b）。由分子Odoribacter和分母RF32中的未分类属组成的微生物特征对结肠长度具有很强的预测能力，而由特布尔西菌、乳球菌和Eubaterium组成的微生物特征对结肠指数具有很强的预测准确度（图9c）。此外分子特布尔西菌和分母粪球菌的微生物特征强烈地预测了结肠中柠檬酸杆菌的数量（图9d）。在本研究中有两个OTU被指定为柠檬酸杆菌，而7个OTU被分配到特布尔西菌。所涉及的OTU的代表性序列也已映射到核糖体数据库项目数据库中的柠檬酸杆菌，但具有90％的相似性水平。这些数据表明在小鼠模型中鉴定出的特布尔西菌属可能是由于柠檬酸杆菌引起的。
图九：与小鼠结肠炎的病理生理表型有关的微生物特征或平衡。
总结
目前对结肠炎相关疾病的治疗主要集中在炎症的初始阶段，使用基于饮食的疾病干预方法可能会为IBD的治疗提供更好的选择。长期摄入KO的全部益处可能来自多种代谢和信号通路的协同作用。本试验利用体外和体内结肠炎模型及多组学研究方法对KO调节肠道微生物和代谢组的机制进行了研究，结果显示KO可呈剂量依赖性显著降低LPS诱导的人巨噬细胞IL-1β和TNF-α的分泌，调节过程涉及NF-κB和NOD-样受体信号通路，并在缓解炎症途径中与COX2和IKK2抑制剂具有协同作用。此外KO通过促进M2极化和增强巨噬细胞介导的细胞内细菌杀伤而参与炎症的缓解。通过饲喂KO可部分恢复猪毛尾线虫感染引起的猪寄生虫依赖性肠黏膜损伤和微生物紊乱。KO的补充降低了立克次体和几种乳酸杆菌丰度，这是通过随机森林分析确定的有助于KO添加分类精准性重要特征之一。确定了几个对感染和补充具有强预测能力的微生物特征。采用非靶向代谢组学方法鉴定KO对组氨酸代谢的抑制作用。通过抑制结肠粘膜中编码L-组氨酸脱羧酶基因的表达和减少微生物来源的组胺生物合成，补充KO降低了与组氨酸代谢相关的几种关键代谢物。利用柠檬酸杆菌诱导的Th1依赖性结肠炎小鼠模型验证了KO的促分解特性。鉴定出小鼠结肠炎相关病理生理特征中具有高预测准确性的微生物特征。该研究结果为优化IBD治疗中微生物启发的替代疗法提供了机制基础。鉴定出的对结肠炎表型有强预测准确性的微生物特征将有助于促进与适当饮食干预以控制肠道炎症的相关的生物标志物的开发。
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