疫苗要想真正上市，还需要更长的时间。
文
肖漫
雷锋网消息，近日，瑞士科研团队在已知新冠病*基因序列的基础上，通过反向遗传学手段在酵母菌中快速构建出了活的新冠病*。
据悉，该技术能高效合成新冠病*，尤其在新爆发病*尚未被成功分离出之前，可以帮助科学家尽快向卫生部门和实验室提供传染性病**株，且该替代方案更为高效、安全。
其论文成果“RapidreconstructionofSARS-CoV-2usingasyntheticgenomicsplatform”于年2月21日发表于BioRxiv，尚未经同行审议。
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利用反向遗传学构建新病*，意义何在？
公开资料显示，该项研究的科研团队大多来自瑞士伯尔尼大学的科学家，他们联合德国、俄罗斯多所科研院校与相关卫生机构共同完成了该科研成果。
研究团队认为，利用已知的病*基因组序列，通过反向遗传学手段快速构建出了新冠病*，可以成为向卫生部门和实验室提供传染性病**株的替代方法，还可以对单个基因进行遗传修饰和功能表征，从而争取时间对疫情爆发做出快速反应。
论文中提到，反向遗传学被认为是一种不可或缺的工具，它能够改变了人类对病*发病机制和疫苗开发的认识。
像冠状病*基因组这一类大型的RNA病*基因组，由于基因组较大且不稳定，很难在大肠杆菌宿主中被克隆和操作，因此需要一种快速而强大的反向遗传学平台进行研究。
此次，瑞士研究团队报道了一个基于酵母的合成基因组学平台，用于多种RNA病*的基因重建，包括冠状病*科、*病*科和副粘病*科等。
研究人员利用病*分离物、克隆病*DNA、临床样本或合成DNA生成病*亚基因组片段，然后使用转化偶联重组技术(TAR）克隆技术将基因组维持为酵母人工染色体（YAC），从而在酿酒酵母中实现一步重组。而T7-RNA聚合酶则被用于产生病*RNA，进而可以产生活病*。
研究团队首先在其他RNA病*（如鼠肝炎病*MHV）中检验了这一平台的准确度，团队测试了鼠肝炎病*A59株中含有绿色荧光蛋白（MHVGFP）的基因克隆能力，结果表明测试的克隆中正确组装了MHV基因组的YAC占90%，这表明病*在酵母中的组装效率很高。
也正是利用该平台，研究人员在拿到合成DNA片段后一周内，对新冠病*进行了工程改造和复活。
值得一提的是，这是一项根据已知病*基因组进行病*重建的基础研究工作，该成果与此前的谣言之一“新冠病*是人工合成的”无关，该研究中实验室中构建的新冠病*是在疫情爆发后，根据已经公布的病*基因组序列进行的病*重建研究。
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如何对新型冠状病*进行工程
改造和复活？
具体来看，研究团队将病*基因组分成12个片段，大小在0.5kbp-3.4kbp。同时，为了便于血清学诊断和在细胞培养时追踪，研究团队将合成新冠病*设计成可以表达GFP（绿色荧光蛋白）。
因此，研究团队又将片段11分成3个包含GFP序列的子片段，GFP序列被插入ORF7a（开放阅读框，ORF）中从而在总计有14个片段。
研究团队让试剂公司化学合成上述14个DNA片段，1月14日下订单，2月4日拿到其中的12个片段。片段5和7在大肠杆菌中的克隆出现一些问题未能完成。
不过，研究团队恰好同时获得了慕尼黑一位患者的新冠病*样本（SARS-CoV-2/München1.1//），他们决定利用RT-PCR扩增获得片段5和片段7。
利用TAR克隆，研究人员获得了所有6种新冠病*构建体正确组装的分子克隆。
随后，研究人员利用转化偶联重组技术（TAR），用酵母菌的同源重组系统依据末端重复的序列，将这些DNA序列拼到一起。
获得完整的病*序列后，研究人员用T7RNA聚合酶将这一DNA序列转录为病*RNA，将该RNA用电穿孔技术导入到VeroE6（猴肾细胞）中，使得细胞被感染，培养这些细胞的上清液（含释放出的病*颗粒）注入到别的培养基中，可以感染别的细胞。
基于此，瑞士研究团队宣布，他们能在获取病*的合成DNA片段后仅一周的时间内，对最近流行的新冠病*的化学合成克隆进行工程改造和复活。并且，其病*的重组有很高的效率和准确度，通常情况下，超过90%的克隆是正确的。
值得注意的是，研究人员还指出，尽管此前在酵母中进行同源重组已被用于很多分子病*的克隆，但这一研究在对通过这种方法快速生成大型RNA病*的全长cDNA的可行性进行了全面评估，尤其是这种大型RNA病*在大肠杆菌中无法被稳定克隆。
值得注意的是，除新冠病*外，研究团队还报道了利用该技术合成构建MHV（鼠肝炎病*，一种冠状病*）和MERS-Cov等，而HCov-E和Zika病*的构建仍在实验进行中。
雷锋网注：文章内容源于biorxiv，雷锋网编译。
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