本期与大家分享一篇于年5月发表在皮肤科权威志BritishJournalofDermatology（BJD/英国皮肤科学杂志）的一篇论著，该文献详细研究并提示寻常型天疱疮患者的皮肤棘层松解是否有ADAM10参与取决于患者的自身抗体谱情况，同时探讨了可能的细胞内信号传导通路。
文献来源
IvarsM,Espa?aA,AlzugurenP,etal.TheinvolvementofADAM10inacantholysisinmucocutaneouspemphigusvulgarisdependsontheautoantibodyprofileofeachpatient.BritishJournalofDermatology.;(5):-.
写在前面：本文主要为医学专业人士准备，患者朋友可以直接阅读文末“致患者”部分。
01
摘要
背景寻常型天疱疮（PV）患者皮肤的棘层松解可能是由针对桥粒芯蛋白（Dsg）和非Dsg的自身抗体引起的。每个病人的自身抗体谱的不同会导致不同的细胞内信号传导模式。
目的根据研究者之前的研究结果，研究者旨在阐明小鼠模型中PV的棘层松解是否有通过激活金属蛋白酶10（ADAM10）的参与。
方法研究者采集了3名PV患者的三种PV-IgG组分（抗Dsg1和抗Dsg3抗体水平存在差异，以及只有1名患者抗桥黏素（Dsc）抗体）为阳性，并将PV-IgG注射入小鼠表皮中。
结果虽然所有PV-IgG组分均产生基底层上方的棘层松解，但只有含有抗Dsg1/3而无抗Dsc2/3抗体的PV-IgG，可以通过诱导ADAM10（Src依赖）激活，并导致表皮生长因子（EGF）受体的配体EGF和细胞素（BTC）升高。相反，同时存在抗Dsc2/3抗体及抗Dsg1/3抗体的PV-IgG，导致了非ADAM10介导的棘层松解，并且EGF和BTC未升高，同时也导致了更早出现的及更严重的棘层松解。
结论研究结果表明，抗Dsg抗体水平的不同或非抗Dsg抗体的存在，如抗Dsc抗体等，会导致不同程度的棘层松解，以及发生机制是否依赖于ADAM10取决于抗体类型。这些不同的PV患者的棘层松解机制可能是与自身抗体与Dsg或非Dsg蛋白结合，并激活特定的细胞内下游传导通路。
02
研究背景
PV是一种累及皮肤及黏膜的自身免疫性大疱性疾病，特点为患者血清中存在抗Dsg的抗体。患者临床及组织学病变程度基本与抗体水平相当，同时皮肤和粘膜中的Dsg1和Dsg3的特殊分布对PV发病机制提出了另一种解释“桥粒芯蛋白补偿理论”。基于以上发现，“单病源理论”的抗Dsg抗体足以解释大多数PV患者的临床表型和水疱形成。另一方面，“多源致病理论”通过“多重撞击假说”对基底层上的棘层松解进行解释。因此，抗Dsg和非Dsg抗体可能都参与到了棘层松解的发病机制当中。患者的自身抗体谱的不同会导致细胞内信号传导模式以及临床表型的不同。
ADAM为金属蛋白酶家族中的一员，对细胞黏附、迁移及信号传导均起到重要作用。具有功能的ADAM与多种粘附分子和生长因子受体的配体的胞外域部分脱落有关，如EGF和BTC。这两种配体激活表皮生长因子受体（EGFR）并且在发生棘层松解的表皮中浓度升高。ADAM10表达于上皮细胞，它的功能是由蛋白激酶如Src介导的，并且与一些表皮炎性疾病有关。
基于以上发现和之前的研究结果，研究者证明了ADAM10的活性和EGFR配体水平均以Src依赖的模式升高，以及基底层上方棘层松解的出现时间和严重程度取决于不同患者的PV-IgG水平。
03
研究方法
1.收集患者血清及提取抗体IgG
提取3名患者（PV1-3）血清中的IgG，患者抗体水平如下表（表S1）
2.小鼠模型中抗体及抑制剂的注射
a.新生24-48小时的C57BL/6J小鼠分别皮内注射以下PV-IgG：
1）分别注射剂量为2mg/g的PV1-3-IgG；
2）经过对抗Dsc3免疫吸附后的PV-3-IgG（抗Dsc3抗体水平约下降50%）；
3）PV2-IgG+PV3-IgG不同浓度配比：1.9mg/g+0.1mg/g,1.5mg/g+0.5mg/g,and0.5mg/g+1.5mg/g
4）健康患者血清中的IgG（NHS-IgG）作为阴性对照
小鼠会在不同时间（注射IgG后15、30分钟，1、2、4、6、8及12小时）被处死，并通过组织病理学证实棘层松解的程度，同时临床水平上通过是否存在尼氏征进行评分。
b.抑制剂注射
小鼠在IgG注射前2小时接受不同抑制剂注射，并进行临床及组织病理学评估。
抑制剂包括：PP1(Src抑制剂,剂量1μg/g,;Calbiochem,Cambridge,MA,U.S.A.);GIX(ADAM10抑制剂,剂量μg/g,AOB;AOBIOUS,Gloucester,MA,U.S.A.;andML;Sigma,StLouis,MO,U.S.A.)andCL(EGFRinhibitor,剂量10μg/g,;Calbiochem)。同时我们也应用了西妥昔单抗(cetuximab)(Erbitux;MerckSerono,Darmstadt,Germany)，通过抑制EGF与EGFR结合发挥作用，剂量为μg/g，与上述抑制剂给药时间相同。
具体评分标准
临床评估：
(0)尼氏征阴性，无自发水疱；
(1+)尼氏征轻度阳性，无自发水疱；
(2+)尼氏征轻度阳性，轻度自发水疱；
(3+)尼氏征明显阳性，水疱局限在注射范围内；
(4+)尼氏征重度阳性，水疱超出注射范围
组织病理学评估：
(0)无棘层松解；
(1+)棘层松解累及25%表皮层；
(2+)棘层松解累及25%-50%表皮层；
(3+)棘层松解累及50%-75%表皮层；
(4+)棘层松解累及全层
3.组织病理、免疫组化及免疫荧光分析
从注射部位采集的皮肤样本固定在用福尔马林缓冲液中，并采用上述评分标准进行评估。主要采用兔多克隆抗ADAM10抗体(AB;Abcam,Cambridge,U.K.)；兔多克隆磷酸化-Src-家族(Tyr)抗体(;CellSignalingTechnology,Beverly,MA,U.S.A.)以及兔多克隆磷酸化-EGFR(Tyr)(44-G;ThermoFisherScientificInc.,Waltham,MA,U.S.A.)
4.ADAM10活性与EGF和BTC水平测定
对注射部位的皮肤匀浆中上述蛋白进行测定。ADAM10酶活性通过荧光测定法（(SensolyteADAM10ActivityAssayKit‘Fluorimetric’,AS-;AnaSpec,Fremont,CA,U.S.A.)。EGF和BTC水平通过ELISA进行检测，使用以下试剂盒：MouseEGFQuantikineELISAKit(MG00;RDSystemsInc.,Minneapolis,MN,U.S.A.)及HumanBetacellulinELISAKit(ab;Abcam).
蛋白质数量级分别为μg、μg和μg，分别用于ADAM10活性，EGF及BTC水平测定。
04
研究结果
1.PV-IgG注射后组织学棘层松解和皮肤剥脱（尼氏征）出现时间
注射PV1-IgG和PV2-IgG的小鼠12小时后出现临床症状(3+)，并分别在8小时和6小时观察到棘层松解(2+)。PV3-IgG早在4小时后就诱导水泡形成(2+)，在6小时出现更强烈的棘层松解(4+)。注射PV3-IgG12小时后，皮肤剥脱超出注射区域(4+)。NHS-IgG未诱发尼氏征(0)或棘层松解（0）（图1和图2）。有趣的是，当小鼠以不同比例注射PV2-IgG+PV3-IgG（含有类似水平的抗Dsg3抗体，但是抗Dsc2/3抗体水平逐渐下降），基底上棘松解症的严重程度逐渐变低（图2）。
图1
图2
2.ADAM10的表达及活性
注射PV-IgG后，免疫组化分析显示ADAM10表达在表皮基底层细胞的细胞质和细胞膜中，在棘层松解以及非棘层松解细胞中均有表达。注射NHS-IgG后，也观察到ADAM10表达在表皮基底层细胞的细胞质和细胞膜中（图3）。
图3
注射NHS-IgG的小鼠ADAM10活性没有表现出明显变化。PV1-IgG和PV2-IgG分别注射后的30分钟和60分钟，ADAM10活性出现显著增加，其中PV2-IgG组升高更加明显（相对PV1表现为较低Dsg1抗体水平和较高的抗Dsg3抗体水平）。相反，注射PV3-IgG后ADAM10活性并没有随着时间推移升高（图4a）。另一方面，注射抗Dsc3部分免疫吸附后的PV3-IgG，或PV2+PV3IgG（1mg/g+1mg/g）ADAM10活性与PV3-IgG相比分别升高1.6±0.26和1.4±0.15倍。
图4a
3.EGF与BTC的释放
小鼠注射PV1-IgG分钟后可观察到EGF和BTC均显著升高。PV2-IgG注射后60分钟即出现EGF和BTC明显升高，这与上述PV2-IgG诱导更高的ADAM10活性结果一致。在这两种情况下，EGFR配体的升高均在ADAM10活性最高时发生，并且在观察到组织学棘层松解之前出现。注射PV3-IgGorNHS-IgG后EGF和BTC均未升高（图4b，4c）。
图4b
图4c
4.PV-IgG注射后Src活性变化
研究者通过分析Src的两种磷酸化底物的特殊位点Src(Tyr)andEGFR(Tyr)的磷酸化程度判断Src的活性。研究者采用免疫荧光法发现，在注射PV1-3-IgG后的30和60分钟，pSrc(Tyr位点的自磷酸化形式)和pEGFR(Tyr)在表皮基底细胞中表达。NHS-IgG注射后，均未检出pSrc(Tyr)和pEGFR(Tyr)荧光染色。（图5a，5b）用Src抑制剂PP1预处理后的所有小鼠均无pSrc(Tyr)和pEGFR(Tyr)的表达，也证实了上述结果。
图5a,5b
5.Src和ADAM10抑制剂预处理后ADAM10活性与EGF、BTC水平变化
在PV-IgG和NHS-IgG注射前给予Src或ADAM10抑制剂，ADAM10活性、EGF和BTC水平没有升高（图6）。这表明EGF和BTC的胞外域脱落是通过src依赖的ADAM10活化介导的。
图6
6.Src、ADAM10、EGFR抑制剂和西妥昔单抗预处理的效果观察（临床病损与组织学棘层松解）
注射PV1-IgG和PV2-IgG的小鼠采用Src、ADAM10和EGFR抑制剂预处理后，临床表皮剥脱（Nikolsky征）与组织学棘层松解并未发生。（图7）采用西妥昔单抗预处理也得到了同样的结果。令人惊讶的是，每种抑制剂都不能阻止注射PV3-IgG的小鼠出现临床和组织学病变（图7）。当抗Dsc抗体水平逐渐增加，同时保持相似水平的抗Dsg3抗体水平（使用不同比例的PV2-IgG+PV3-IgG），基底层上方的棘层松解症的严重程度似乎与有无ADAM10抑制剂预处理无关（图2）。
图7
05
讨论
本研究中的数据表明PV患者的ADAM10的活性及基底层上方棘层松解的时间和严重程度可能取决于PV患者的自身抗体谱情况。目前已发现上百种非抗Dsg抗体，约25-60%非经典表型患者血清中发现了抗Dsc抗体。利用蛋白质组学技术，约44%的PV患者血清中发现了抗Dsc抗体。这些自身抗体与具有特异性及致病性，以及Dsc3内化与细胞-细胞分离有一定相关性，并且与经典PV相同，可导致基底层上方的棘层松解。
有趣的是，非Dsg抗体（包括Dsc抗体）之间的协同作用在无Dsg抗体的PV基底层上方棘层松解中起着重要作用。研究者既往研究了EGF和BTC与PV患者表皮棘层松解有关，并由此想到ADAM10也可能参与到该机制当中。ADAM10在细胞与细胞间接触位点的表达提示它可能参与细胞间的相互作用。在人类中，ADAM10似乎表达在表皮的基底细胞层中。
为了阐明ADAM10活性是否受到PV-IgG的影响，研究者对注射PV-IgG和NHS-IgG的小鼠进行ADAM活性测定。有趣的是，研究者发现ADAM10的活性在注射PV1-IgG和PV2-IgG后60分钟升高至最大值，并且注射PV2-IgG后ADAM10活性更高。令人惊讶的是，注射PV3-IgG后ADAM活性并没有升高。由于PV2-IgG含有较高的抗Dsg3和较低的抗Dsg1抗体水平，研究者推测ADAM10活性与抗Dsg3的水平相关性更大，这也可能解释了为什么注射PV2-IgG后比PV1-IgG更早出现棘层松解。
ADAM10抑制剂GIX可抑制DAM10的激活，并阻止注射PV1-IgG和PV2-IgG的小鼠出现临床病损和组织学棘层松解。相比之下，研究者观察到PV3-IgG，除抗Dsg1/3抗体外，也含有抗Dsc2/3抗体（不清楚其他非抗Dsg抗体是否有这种情况），可诱导非ADAM10介导的棘层松解，且细胞分离出现的更早、更重。曾有报道说同时具有抗Dsg3和抗Dsc3抗体的PV患者，似乎只有后者是致病性抗体，且棘层松解的程度和出现时间更取决于抗Dsc抗体水平。研究者的发现与其一致，研究者发现当抗Dsc2/3抗体水平逐渐降低，而抗Dsg3水平基本维持不变时，棘层松解程度减轻。此外，当PV3-IgG组分中的抗Dsc3抗体减少时，无论是通过免疫吸附还是用与PV2-IgG配比稀释PV3-IgG，并且抗Dsg3抗体水平保持不变的情况下，给予PV-IgG可使ADAM10活性分别升高60%或30%左右。这种差异可能是由于抗Dsg1和/或其他非Dsg抗体的不同水平导致的。这些结果表明当PV-IgG同时含有抗Dsc2/3抗体和抗Dsg1/3时，如PV3-IgG，可能会触发不涉及ADAM10激活
的不同细胞内机制。
ADAM10的活性可能是Src介导的，并且此蛋白激酶是PV棘层松解所必需的。研究者采用的3个PV-IgG组分早在注射30分钟后就增加了基底层Src的活性，且如预期一样在ADAM10活性增加之前。当研究者使用Src抑制剂时，三种经PV-IgG注射的小鼠中pSrc（Tyr）和pEGFR（Tyr）完全没有表达，但临床病损和组织学棘层松解仅在PV1-IgG和PV2-IgG组被抑制。此外，用Src抑制剂PP1预处理小鼠后，ADAM10活性没有升高。综上所述，以上数据表明所有PV-IgG组分都引起了Src活性的升高，但只有PV1-IgG和PV2-IgG表现出Src介导的ADAM10活性的增加，进而导致小鼠表皮细胞分离。含有抗Dsc2/3抗体的PV3-IgG可升高Src活性但不增加ADAM10活性，所以ADAM10并未参与到棘层松解的机制当中。向小鼠注射抗Dsc3抗体水平降低的PV-IgG组分可升高ADAM10活性，由于ADAM10抑制剂不能阻止细胞-细胞分离，可见棘层松解仍然不是ADAM10介导的。PV-IgG中的低水平抗Dsc3抗体足以诱导非ADAM10介导的棘层松解。这可以通过抗Dsg抗体与角质形成细胞结合来诱导集群变化来解释，导致形成不同的含有脚手架以及信号蛋白的复合物，而活性通过其富含脯氨酸的区域相互作用来调节ADAM10的位置和活性。
研究者试图评估ADAM10的功能是否与EGF和BTC的胞外区剪切脱落有关。PV1-IgG和PV2-IgG导致EGF及BTC水平显著增加，且当ADAM10活性达到最高时，达到最高水平。如同预期，PV3-IgG没有引起EGF或BTC释放。当经过Src或ADAM10抑制剂预处理后，PV1/2-IgG并未引起EGF及BTC的水平改变。研究结果表明几种PV-IgG类型通过ADAM10介导的方式导致了棘层松解，至少只有部分通过EGF和BTC的释放，考虑到西妥昔单抗和EGFR抑制剂只能阻止PV1/2-IgG诱导的棘层松解。与之相反，含有抗Dsc抗体的PV-IgG似乎并不依赖EGF、BTC和EGFR的方式诱导棘层松解，尽管研究者观察到Src可对EGFR进行反式激活。是否存在其他可能参与黏附或信号传导的膜蛋白，且与ADAM10在空间上及胞外域脱落有关，需要进一步研究。
综上所述，PV棘层松解是通过抗体与Dsg或非Dsg蛋白结合，进一步激活细胞内信号通路下游的结果。多数患者血清中存在抗Dsg抗体且无抗Dsc抗体，是通过Src依赖的ADAM10介导产生棘层松解。这类患者棘层松解的程度与出现时间与抗Dsg3抗体水平相关。此外，ADAM10、Src或EGFR抑制剂和西妥昔单抗可抑制此类患者的棘层松解，并且可作为鉴别点。相反，除抗Dsg1/3抗体外，也有抗Dsc2/3抗体（可能还有其他非Dsg抗体）的存在，定义了另一类PV患者，其棘层松解出现更早且更严重，并由早期非ADAM10介导的机制触发，可能是空间位阻或其他非ADAM10依赖的信号通路（图8）。
图8
致患者朋友的话
评估天疱疮的病情，医生经常会开具抗桥粒芯蛋白1和3（Dsg-1/3）抗体的抽血检查，是因为这是已知的一种导致天疱疮的致病性抗体，可以理解为一种引起天疱疮的“*素”。人的表皮要保持完整，除了Dsg以外，还有其他蛋白质如桥黏素（Dsc）。本篇文章阐述了当血液中抗Dsg与抗Dsc同时存在时，其导致发病的机制是有所不同的。
本篇文献中给实验用的小鼠先注射了一些特殊的抑制剂，再注射仅含有抗Dsg的抗体后，便没有出现病损及病理学的棘层松解现象，那么这些抑制剂是否可以应用到患者的临床治疗当中呢？对于抗Dsc抗体阳性的患者而言，如果对该抗体致病的信号传导通路研究清楚后，也可能发现新的特异性抑制剂，那么对于天疱疮患者的治疗方法上又会有新的选择了。本篇文献为日后对于天疱疮患者的治疗提供了新的思路和方法，不过仍需要大量的实验和研究，让我们拭目以待吧。
翻译排版：陈曦医师
审校：王明悦副主任医师、副教授
图片来源于原文
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