一、AHPND简介
自年以来，急性肝胰腺坏死病（AHPND），也被称为“早期死亡综合症（EMS）”，在很多东南亚国家，包括中国，越南，马来西亚，泰国,菲律宾流行，并已经给养虾业造成巨大损失。年，在西半球，特别是在墨西哥，以及年在美国确认发现AHPND的存在，这种新出现的疾病已经造成全世界虾类水产养殖损失亿美元，尤其是由于该病迅速传播，AHPND现在对全球虾类养殖构成了严重威胁。
AHPND的病原体包含不同菌株，包括副溶血性弧菌，哈氏弧菌，欧文斯氏弧菌...，含有双元*素PirAB，并且PirA和PirB*素已被确认为该疾病的致病因子。在PirAB基因大质粒(69-70kb)中，位于3.5kb的转座基因片段中，转座基因可能参与插入和删除事件，导致pirAB区域突变，可能影响AHPND弧菌株的致病性。
AHPND通常在投放苗后20到30天出现，在严重情况下可导致高达％的死亡率。然而，一些研究报告表明，大小（6-15克）之间的南美白对虾和斑节对虾的虾苗也会受到影响。在急性期，被感染的肝胰腺（HP）表现为肾小管上皮细胞脱落，这导致上皮细胞向小管腔内脱落。在该病末期，肝胰腺出现广泛的肾小管间血细胞凝集，导致肝胰腺功能障碍和和严重的继发弧菌感染。在最近的研究中，描述了AHPND的新阶段，即慢性阶段，其特征是HP小管中存在肉芽肿反应，并伴有细菌，类似于败血症性肝胰腺坏死（SHPN）。
在这项研究中，我们发现了两个新颖的突变体（R13和R14），在世界动物卫生组织(OIE)批准的PCR方法中检测出一种或两种*素基因均呈阳性，即(R13仅检测出pirA，R13检测出pirA和pirB)，但在实验中并未导致爆发AHPND。这项发现，对于以后AHPND疾病的确定与研究，具有重大意义。
二、研究材料和方法
2.1.导致爆发AHPND的弧菌和突变体这项研究使用了来自亚利桑那大学水产养殖病理实验室的四株副溶血性弧菌，包括是从越南被AHPND感染的虾中分离的引起AHPND的菌株（A3），用作VPAHPND参考菌株。此外，来自拉丁美洲国家的副溶血性弧菌R13和R14。
2.2.AHPND挑战测试从美国一家商业供应商处购买的无特定病原体（SPF）南美白对虾用于AHPND攻击测试，以确定副溶血弧菌R13和R14的致病性。参考菌株VPAHPND（A3）作为对照组，R13、R14、VP-ATCC（V13、R14混合组）作为研究组。
在28°C、盐度为25ppt的条件下进行了实验，每组放入SPF南美白对虾（平均重量7.1g），分别使用副溶血弧菌A3、副溶血弧菌R13、副溶血弧菌R14，（副溶血弧菌R13、R14混合组），攻击南美白对虾。从实验开始每天记录死亡率，收集死虾样品以通过PCR确定AHPND的存在，实验结束后将所有幸存虾固定下来进行组织病理学分析。
2.3.组织病理学按照标准方法，处理（AFA）固定样品，将其包埋在石蜡中并切片（4μm厚）,用苏木精/伊红染色实验(HE)染色后，通过光学显微镜分析切片。
2.4.序列分析取AHPND参考菌株A3，副溶血弧菌R13和副溶血弧菌R14中含有双元*素基因pirAB的质粒DNA序列，进行序列分析。
三、研究过程
3.1.双链PCR检测pirA和pirB样基因图1显示了使用来自拉丁美洲的副溶血性弧菌分离物的总基因组DNA,通过DNAPCR扩增pirA和pirB基因。在副溶血性弧菌菌株（A3）中，检测到了bp（pirA）和bp（pirB）的扩增子。在分离株R13中，仅检测到对应于pirB的扩增子（bp），而在R14中，成功检测到pirA和pirB基因。
图1.通过DNAPCR从副溶血性弧菌分离物中产生的pirA和pirB扩增子的照片。
3.2.实验结果、组织病理学和PCR结果使用菌株A3进行的实验，1天后的SPF虾死亡率达到％。但是，在用R13，R14研究中没有发现有死亡病例（图2）。健康和细菌感染的虾头胸腹侧切片如图3所示，来自R13、R14与A3的肝胰脏样品出现不同的变色。感染了A3菌株的虾出现AHPND的临床体征特征，包括肝胰脏苍白变色和萎缩（图3b）。相反，用R13，R14，VP（R13，R14混合）菌株攻击的虾中未显示任何临床体征，并且肝胰脏未显示任何变色或萎缩。
在用A3攻击的死虾中，pirA和pirB基因均可通过双链PCR扩增。在R14中，pirA和pirB基因均可通过
双链PCR从受攻击的虾中扩增。在R13菌株中，只能扩增pirB基因，而不能扩增pirA基因。
图2.感染四种不同的副溶血性弧菌（A3，R13，R14，VPATCC（R13，R14混合）），南美白对虾的最终存活率。
图3.用四种不同的副溶血弧菌攻击南美白对虾，虾的临床特征
VPAHPNDA3攻击的虾的组织病理学表明，急性期AHPND的典型病变包括多灶性坏死和肝胰腺中部区域的肝胰腺小管上皮细胞大量脱落，并向外发展（图4.C）。但是，在在R13，R14、VP的虾中，未观察到AHPND的临床症状。在所有检查的虾中，肝胰管中均出现高水平的空泡（G3）。
图4.用四株副溶血弧菌攻击南美白对虾的肝胰脏（HP）的组织学切片。（A）VP-ATCC；（B）R13；（C）A3;（D）R14。
3.3.RT-PCR检测pirA和pirB在用R14菌株攻击的虾中检测到双元*素基因pirA和pirB，而在用R13攻击的虾中仅检测到pirB基因（图1）。为了进一步证实*素基因不表达，提取总RNA，并使用cDNA进行RT-PCR扩增pirA和pirB基因，如图5所示。pirA基因无法通过RT-PCR在R13中扩增;同时，R14和A3菌株显示了*素基因的表达（图5）。
图5.pirAB基因的聚合酶链反应扩增。
3.4.序列分析副溶血性弧菌菌株A3以及突变菌株R13和R14携带多元*基因的质粒DNA的遗传特征，见表1和图6。
图6.分离株R13、R14、A3形式的比较。
图7：A3，R13和R14的启动子区域和转录因子结合位点
表1.副溶血性弧菌参考菌株A3和突变菌株R13和R14中携带*素基因的质粒DNA的遗传特征。
3.5.蛋白印迹法（WesternBlot）检测二元*素使用PirA和PirB多克隆抗体，在参考菌株A3中检测到PirA和PirB*素，而在R13，R14,VPATCC菌株中未检测到。（图8a，b），结果证实多元*素仅在副溶血性弧菌A3中出现。尽管通过RT-PCR在R14中检测到pirA和pirB，但在R13和R14菌株中均未出现多元*素。
图8.从副溶血弧菌R13，R14，VPATCC和A3菌株中提取的蛋白印迹分析
四、研究讨论
1、在这项研究中，我们发现了两个副溶血性弧菌突变型非致病性菌株R13和R14，它们带有pVA3质粒，并含有pirA或两个pirAB基因，但没有引起虾的死亡。这些发现对AHPND诊断具有重要意义，因为仅检测pirA和pirB基因不足判断是菌株可引起AHPND。
2、使用RT-PCR，确定R13菌株不产生pirABmRNA，而R14确实产生pirA和pir两者的mRNAB基因，同时，通过蛋白印迹分析未检测R13、R14含有*素，因此这两种菌株不会引起南美白对虾的死亡。只有副溶血弧菌菌株（A3）产生PirA和PirB*素，并引起AHPND。
3、据相关研究表明，虾要引起AHPND，必须有两种*素pirAB的成分，在R13中，pirA基因的缺失破坏了相应*素的表达，因此，该菌株无法产生引起AHPND的多元*素。但是，菌株R14的独特之处在于能够表达pirAB基因，但是它不会产生引起虾AHPND病变的*素。可能由于多种因素*素被破坏。
五、研究结论
一些副溶血性弧菌分离株携带突变的pVA质粒，这些质粒不产生PirAB*素，并且在使用SPF虾进行实验时不会造成死亡。
我们尚不了解R14菌株*素被抑制的机制，未来的研究将集中于这方面的研究，但目前的研究确定了一个事实：即仅基于PCR的检测无法确定引起AHPND的菌株，需要通过生物测定，组织病理学和多元*素的检测（这个才是重点），来确认AHPND的真正病源。
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