点评
魏文胜、伊宗裔（北京大学）、陈佳（上海科技大学）
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木兰之枻
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兮
#基因编除细胞核外，真核生物的线粒体中也有独立的遗传物质DNA存在。线粒体基因组突变会导致多种母系遗传病，且与衰老及各类疾病密切相关。目前已知的线粒体致病突变有95种，其中绝大多数为点突变（90/95）。致病点突变包含9种A-G突变和39种C-T突变。为开展功能研究和疾病治疗探索，研究者以TALENs技术为基础，结合双链DNA脱氨酶DddA，开发出可在线粒体基因组中实现C-T单碱基编辑的新工具DdCBE（Nature新突破
DavidLiu开发新工具实现线粒体内的高效单碱基编辑；NBT
DavidLiu团队开发CRISPR非依赖的线粒体胞嘧啶碱基编辑器DdCBEs的升级之路）。除DdCBEs外，目前针对线粒体基因组的其它类型精准编辑工具依然一片空白。
年4月25日，来自韩国韩国基础科学研究所(IBS)的Jin-SooKim实验室在Cell发表题为TargetedA-to-GbaseeditinginhumanmitochondrialDNAwithprogrammabledeaminases的论文。文章在线粒体基因组精准编辑工具DdCBE的基础上，进一步结合腺嘌呤脱氨酶TadA的研究成果，开发出了可对线粒体基因组进行A-G精准编辑的新工具TALEDs。这一类新工具的出现将极大的推动线粒体功能和线粒体疾病的基因治疗研究。
DNA精准编辑工具的研发过程中，研究者曾通过蛋白定向演化技术对腺嘌呤脱氨酶TadA进行改造并获得突变体TadA8e，TadA8e与CRISPR系统结合可实现细胞核基因组的A-G单碱基精准编辑。本研究中，作者将TALENs技术与TadA8e结合以探索其用于线粒体基因组实现A-G单碱基编辑的可行性，结果显示TALE-TadA8e融合的A-G编辑效率仅0.7%~1.2%。考虑到TadA8e理论上仅编辑单链DNA（ssDNA），其在双链DNA（dsDNA）上的低效编辑依然让研究者惊喜。
研究者推测，DdCBE中的双链DNA脱氨酶DddAtox在碱基编辑过程中或许能促进局部ssDNA的形成。因此研究者将DdCBE中的部分UGI替换为TadA8e并研究其碱基编辑活性（图1）。结果显示，改造后的sTALED-UGI具有明显的A-G编辑活性（19%），同时也保留有C-T编辑活性。研究者进一步删除其余UGI功能域，最终得到的sTALED工具只保留有A-G编辑活性，且对线粒体基因组的编辑效率最高可达49%。活性窗口分析指出，sTALED工具对间隔序列中间位置的A/T碱基有更高的编辑效率。
图1靶向线粒体基因组的A-G编辑工具研发。
研究者还证实，DddAtox的脱氨酶活性对sTALED的A-G编辑能力无明显影响。研究者以失活型DddAtox为基础对sTALEDs进行优化，还重新设计出两种新工具—单体TALEDs（mTALEDs）和二聚体TALEDs（dTALEDs）（图2）。活性分析指出，mTALEDs和dTALEDs均能高效特异性的实现mtDNA的A-G编辑（效率最高可达35%）。不过总体而言，sTALEDs的A-G编辑活性最高，mTALEDs和dTALEDs的活性相似，略低于dTALEDs。研究还指出，三种工具对编辑位点的序列并无明显偏好性，对间隔序列中的A（A-G编辑）和T（T-C编辑）有类似的编辑效率。活性窗口方面，三种工具对间隔序列中间位置的A/T碱基有更高的编辑效率。其中sTALEDs的活性窗口为间隔序列5-12，而mTALEDs和dTALEDs主要为7-12。此外，通过筛选优化TALE结合位点可以进一步改变三种TALEDs的活性窗口，从而满足不同的A-G编辑需求。
图2靶向mtDNA的A-G编辑工具改造与优化。
应用方面，研究者通过单细胞克隆和抗生素筛选实验证实，TALEDs对线粒体基因组的A-G单碱基编辑能稳定遗传。此外，TALEDs在多种细胞中均能实现线粒体基因组的有效编辑，表明TALEDs具有广阔的应用前景。最后研究者还对TALEDs的脱靶效应进行了检测，发现TALEDs在线粒体DNA和细胞核DNA水平的脱靶风险很低。
总体而言，研究者通过对已有的单碱基编辑工具进行组合优选，实现了线粒体基因组精准编辑工具的新突破。研究者证实双链DNA脱氨酶DddA能促进局部ssDNA的形成，并以此为基础，创造性的开发出可介导线粒体基因组A-G突变的新工具TALEDs。考虑到线粒体致病点突变中39/90为C-T突变，TALEDs有望成为修复这类致病点突变的利器，为线粒体功能和基因治疗研究提供了新希望。
专家点评
魏文胜、伊宗裔（北京大学）
线粒体作为细胞内的“能量工厂”，对于维持细胞正常生理功能发挥着至关重要的作用，哺乳动物细胞内DNA主要存储在细胞核内，线粒体作为唯一的核外DNA存储区域，其DNA的突变会造成严重的疾病。因此能够针对线粒体的基因进行编辑对于治疗线粒体DNA突变导致的遗传病具有重大意义。虽然CRISPR编辑系统的发明已经近10年，但是由于线粒体膜电位原因，CRISPR系统编辑所需的负电性guideRNA很难进入线粒体。虽然ZFN和TALEN系统已经成功运用于线粒体的基因敲除，但由于这两套体系并不能对双链DNA进行解旋，因此之前的碱基编辑器所使用的单链DNA脱氨酶都不能用于线粒体的碱基编辑。
年，DavidR.Liu课题组和JosephD.Mougous课题组鉴定出可以在双链DNA上进行CU编辑的脱氨酶DddA（Double-strandedDNA-specificcytidinedeaminase），并将之与TALE相结合，开发出DdCBE系统，成功实现了线粒体DNA上CT的编辑。然而CT的编辑仅能修复部分线粒体遗传相关疾病，而已知的线粒体疾病中有近一半需要通过AG的编辑来修复。年4月25日，Jin-SooKim课题组在Cell杂志上报导了TALED编辑器，首次实现了线粒体DNA的AG编辑，成功拓展了碱基编辑器应用的范围。与DdCBE类似，TALED编辑器也是利用TALE蛋白融合脱氨酶来靶向线粒体，最开始Jin-SooKim课题组使用TALE-TadA8e（TadA的优化版本）来直接靶向线粒体，虽然检测到了AG的编辑，但是效率很低。巧妙的是Jin-SooKim课题组将DddA与TadA来搭配，构建出的TALE-DddA-TadA8e系统竟然能将AG的编辑效率提升至最高40%左右，这是本篇文章中至关重要的发现。随后Kim课题组又对TALED编辑器进行了一系列优化，并表明其在线粒体基因组上与核基因组的部分相关位点没有明显的脱靶现象。
本篇文章中发现DddA和TadA8e这两种酶可以以顺式或者反式作用的方式发挥功能，根据之前JenniferDoudna课题组和DavidR.Liu课题组报导，TadA8e是严格的单链DNA脱氨酶，其对双链DNA活性极低，因此在TALED系统的编辑过程中，TadA8e可能是通过单链DNA发挥功能，这提示着我们DddA在对双链DNA进行脱氨的时候会将部分双链DNA转化成为单链状态，而这种单链才是TadA8e的底物。虽然TadA8e不具有解开双链DNA的能力，但是借助于DddA的特性，可以对线粒体DNA上的A进行脱氨。此外，本篇文章发现TALED系统并没有DdCBE所偏好的5’-TC-3’基因序列，而是对不含有5’-TC-3’的序列也具有高编辑效率，这提示DddA在DdCBE系统和TALED系统中均具有打开双链的活性，且打开双链DNA的过程没有序列偏好性。而在DdCBE中其偏好的5’-TC-3’有可能仅是其酶活中心的特性造成的，与打开双链的能力无关。总结来说，DddA打开双链DNA的能力和偏好性编辑的能力可能是相互独立行使功能的。值得注意的是，目前仍然没有DddA与底物DNA结合的结构被解析，DddA与底物DNA结合的结构会帮助我们理解DddA发挥功能的具体机制，并进一步指导碱基编辑器的开发和优化。
总结来说，Jin-SooKim课题组巧妙地将DddA与TadA来搭配进行靶向线粒体编辑，填补了领域内线粒体DNAAG碱基编辑的空白，也为碱基编辑器的工作原理和新型碱基编辑器的开发提供了新思路。
专家点评
陈佳（上海科技大学）
线粒体DNA（mtDNA）发生突变与母系遗传病，衰老甚至癌症等疾病有关，严重影响人类健康，在目前人类线粒体相关的95个临床确诊的致病突变中有90个是点突变造成的。近期开发的DdCBEs系统由转录激活样效应器（TALE），细菌毒素活性域DddAtox和尿嘧啶糖基酶抑制剂（UGI）组成，可以对mtDNA进行胞嘧啶C到胸腺嘧啶T的编辑。而目前mtDNA的90个临床致病点突变中仅有9个（10%）可被DdCBEs纠正，应用范围受限。因此，mtDNA的碱基编辑系统亟待得到更完善的补充。
Jin-SooKim团队将转录激活子样效应器（TALE）、来自伯克霍尔德氏菌Burkholderiacenocepacia的分离型DddAtox或催化受损的全长DddAtox变体、以及工程化腺苷脱氨酶TadA结合，构建了线粒体编辑工具包TALEDs，可诱导人类细胞线粒体基因组中腺嘌呤A到鸟嘌呤G的编辑。该基因编辑工具在线粒体基因的17个靶点上催化A-G的转换，效率最高可达49%，极大的扩展了mtDNA的编辑范围。
与介导mtDNA中C-T编辑的DdCBEs不同，TALEDs不需要DddAtox所依赖的的基序5’-TC，这扩大了其应用范围。且不同的TALED展现出不同的编辑位点偏好，提示研究人员可选择适当的工具来完成预期的编辑。研究者还进行了TALEDs脱靶效应的研究。在线粒体全基因组测序中，TALEDs的平均全基因组非靶标编辑略高于对照组，且主要编辑类型为A-G。使用TALEDs对ND1位点进行编辑，在TALE序列相同的情况下，TALEDs与DdCBEs产生的非靶向编辑没有重叠，是TALE序列非依赖性的脱靶效应，且大部分脱靶效应都发生在mtDNA的一个长度为1.1kbp的高度多态的非编码D-loop区域中。研究者还证明了含有MTS的TALEDs难以进入核DNA，因为序列极其相似的核DNA位点中检测不到A-G编辑的发生。
总而言之，研究者在这项工作中构建了可对mtDNA进行A-G编辑的TALEDs工具包（sTALED，mTALED和dTALED），能够在细胞系和动物体内产生mtDNA突变，以创建疾病模型；同时也为纠正患者的致病mtDNA突变铺平了道路，预示着线粒体基因编辑治疗新纪元的到来。
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