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最新在CellPress新型冠状病毒资源中心上线的发表在CellPress细胞出版社旗下期刊Cell上的研究，名为“QuickCOVID-19HealersSustainAnti-SARS-CoV-2AntibodyProduction”来自哈佛大学医学院的研究团队对76名受试者随访至约天，发现抗体持续时间动力学表现出明显的异质性。研究阐明了一种有效的免疫表型，将快速症状清除与差异抗体持久性动力学联系了起来。
*以下中文内容仅供参考，请以英文原文为准。
摘要
抗体在免疫反应中非常关键，为机体提供保护以抵御致病威胁。对SARS-CoV-2产生的抗体反应的性质和持久性尚不清楚。我们按时间纵向记录了92名有症状COVID-19患者对SARS-CoV-2的抗体反应。对SARS-CoV-2的抗体反应在大范围内呈单峰分布，症状严重程度与病毒特异性抗体水平直接相关。对76名受试者随访至约天，发现抗体持续时间动力学表现出明显的异质性。病毒特异性IgG在大多数个体中大量衰减，而一个独特的亚群在同一时间段内抗体水平保持稳定或上升，尽管初始抗体量是相似的。这些反应增强的个体从有症状COVID-19的患病状态迅速恢复，病毒特异性记忆B细胞抗体基因的体细胞突变增加，先前激活的CD4+T细胞频率持续增高。这些发现阐明了一种有效的免疫表型，将快速症状清除与差异抗体持久性动力学联系了起来。
简介
由SARS-CoV-2引起的COVID-19已成为一个全球性的重大威胁。从无症状到致命性的感染，COVID-19表现出显著的异质性。我们迫切需要了解SARS-CoV-2免疫反应的本质，以阐明人类对持久保护性免疫的需求和可能性。
COVID-19康复患者产生靶向病毒核衣壳（N）、spike（S）和S受体结合域（RBD）的IgG，这与它们的高中和能力尤其相关（Premkumaretal.,）。然而，这些抗体在大多数轻度SARS-CoV-2感染中的水平很低，在更严重的状况下中产生的水平更高（Longetal.,a;Maetal.,;Wangetal.,）。这些低初始抗体水平已被证明在大多数个体中下降（Beaudoin-Bussieresetal.,;Grandjeanetal.,;Ishoetal.,;Iyeretal.,;Longetal.,b;Seowetal.,）。
虽然恢复期患者的S反应性抗体能够有效中和SARS-CoV-2，但它们大多缺乏体细胞突变（SHM）的证据（Juetal.,;Robbianietal.,;Rogersetal.,）。SARS-CoV-2反应性记忆B细胞的低SHM和弱反应提示GC过程利用率低，这与被报告的严重COVID-19患者的GC外免疫反应（Woodruffetal.,）和GC反应异常（Kanekoetal.,）一致。因此，自然感染SARS-CoV-2是否能导致持续的抗体反应，以及什么可能影响这些反应是关键问题。
为了解决这个问题，我们对COVID-19恢复期患者进行了纵向研究。我们定量分析了血浆IgG和IgM，以及血浆IgG对多种SARS-CoV-2抗原的稳定性，大多数被试都是轻度感染者。我们发现抗SARS-CoV-2抗体分布广泛，且与症状严重程度相关。虽然大多数人表现出IgG衰减，但有一个明显的亚群在同一时间段内显示出持续的抗SARS-CoV-2特异性IgG水平。这个独特的亚群显示症状持续时间更短，症状缓解后不久SARS-CoV2S反应性记忆B细胞抗体基因中体细胞突变增加，先前激活的CD4+T细胞频率增加。这些发现表明了一种独特的免疫表型，将症状性疾病缓解动力学和抗体持久性动力学联系了起来。
结果
被试招募
我们在波士顿马萨诸塞州地区招募了年3月至年6月期间的COVID-19康复患者。每个被试都根据症状和确认性实验室测试得到诊断。其中5人住院治疗，其余均在家中康复，病情大多较轻。在主要症状缓解后采集第一份血样，之后每月重复采集一次。从每个血样中分离血浆和外周血细胞进行分析。
SARS-CoV-2感染的抗体反应水平不一
对血浆抗SARS-CoV-2IgG和IgM的定量ELISA测量显示病毒特异性IgG的3个数量级范围（图1A）。92名受试者中有5名在大流行前未表现出更高的IgG水平，这与先前报告的轻度病例阳性率一致（Harritshoejetal.,;Houetal.,;Meyeretal.,;Rijkersetal.,）。此外，大多数受试者的抗SARS-CoV-2IgM水平接近COVID-19流行前的对照血浆水平（图1B）。Spearman秩序分析发现，年龄和自我报告症状严重程度与抗SARS-CoV-2IgG水平显著相关（图1C）。年龄和严重程度与抗体量的散点图显示了这些特征的共同趋势（图1D-1I）。图S1给出了所有其他的相关散点图和症状严重程度评分范围的说明。自我报告症状严重程度与抗SARS-CoV-2IgG量值之间的直接且高度显著的相关性支持了自我报告严重程度作为该队列中个体之间的公平指标的价值，因为这是一种已建立的相关性（Longetal.,a;Robbianietal.,）。
我们还进行了Luminex分析，以测量特定抗体同型（包括IgM、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4和IgA）对SARS-CoV-2抗原的反应性，以及抗体与Fc受体（FCR）的相互作用（图2）。我们比较了大流行前阴性对照样本与来自COVID-19康复队列的前60名招募受试者之间抗SARS-CoV-2IgG和IgM水平（图2A和B）。Luminex分析证实了基于ELISA的IgG观察结果，在区分对照组和SARS-CoV-2感染者之间的低抗S-IgM水平方面优于ELISA（图2B）。我们观察到10-15%的受试者对抗N、抗S和抗RBDIgG1呈阴性，与ELISA数据一致（图2C）。IgM测量显示，在第一次抽血时，20-49%的COVID-19康复受试者与阴性对照者无法区分（图2D）。抗-N和抗-S或抗-N和抗RBD-IgG1水平之间的强相关性（图2E和2F）表明，部分个体可能在没有可测量抗体的情况下从COVID-19中康复。有可能这些个体的PCR检测为假阳性，但症状存在的标准加上阳性检测使假阳性的可能性降低。
我们使用了一种机器学习潜在变量建模方法来识别最重要的与症状严重程度相关的协变量特征。我们将个体分入低（1-4）或高（5-10）组，并进行正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），其中，有助于区分这两个类别的测量方差被解释为一个潜在变量，该变量由从Luminex和ELISA数据中通过正则化选择的关键特征的加权组合组成（图2G）。结果表明，抗S1-IgG1、抗RBD-IgG滴度、抗N-IgG2和IgG3与高症状严重程度相关（图2H）。该模型基于ROC曲线分析曲线下的区域预测症状严重程度的准确率为65%（图2I）。相关网络分析（图2J）说明了与四个关键特征共变的额外抗体特征，更广泛地代表了最密切相关的免疫系统过程。Luminex分析还包括3种引起流感病毒HA和3种冷致冠状病毒的spike受体结合域。这些抗原的抗体通常不能预测COVID-19疾病的预后（图S2），尽管人类冠状病毒E的IgG确实与COVID-19症状的严重程度相关。
抗SARS-CoV-2IgG三个月的动态变化
我们通过定量抗-N，抗-S，抗-RBD-IgG反复血浆分离来探索抗体衰减动力学（图3）。病毒特异性IgG下降发生在大多数个体中。我们通过计算每个抗原的第3次提取IgG水平除以第1次提取IgG水平的商来量化这种下降，将其定为抗体持久性指数（图3B）。恢复期受试者第三次采血后抗-N-IgG下降88%，抗-S下降72%，抗RBD下降74%。抗N、抗S和抗RBD-IgG的中位抗体耐久性指数分别为0.49、0.65和0.61。这些发现与大多数COVID-19恢复期受试者的IgG反应减弱相一致。
虽然大多数恢复期的受试者表现出下降，但一些个体在同一时间段内抗体生成稳定或增强。我们通过受试者约天的抗体持久性指数，将其分为“持续者”（sustainer）（持久性指数≥1）和“衰减者”（decayer）（持久性指数1）两类进行检验。我们注意到，就一种抗原而言，大多数符合IgG持续者条件的个体也能持续产生对其他抗原特异的IgG（图3C和表S2）。绘制定量（图3D）和第一次采血标准化（图3E）抗体水平的前3次抽血结果显示，持续者抗体水平稳定/增加，而衰减者抗体水平下降。绘制症状出现后几天相同的数据显示，两组之间采血时间的差异相似（图S3A和B）。此外，持续者和衰减者在抽血的时间上没有明显的差异，无论是在症状发生还是症状缓解方面（图S3C-F）。
COVID-19症状的快速缓解与持续抗体产生相关
在完成3次纵向抽血的76人中，72人血清转化。对于这72个个体，我们利用Spearman相关分析探讨了受试者和疾病特征与持续抗体产生之间的关系（图3F）。抗S和抗RBD-IgG持久性指数与疾病症状持续时间呈显著负相关，r值分别为-0.28和-0.27。抗N-IgG持久性指数与症状持续时间无显著相关性，提示抗S抗体和抗RBD抗体具有独特的作用。抗-S（图3G）和抗RBD（图3H）持久性指数和COVID-19症状持续时间之间的相关性的全散点图说明了病程较短和抗体反应更持久之间的关联。抗S-IgG持久性与症状严重程度呈负相关（r=-0.27）。年龄或体重指数与抗体持久性之间没有发现显著相关性（图3F和S4A-S）。
症状持续时间的直接比较表明，抗S-IgG持续者的症状持续时间明显短于抗S-IgG衰减者（图3I和3K）。与抗RBDIgG衰减者相比，抗RBDIgG持续者的症状持续时间也显著缩短。对年龄、体重指数和症状严重程度的类似分析没有发现显著差异（图S4T和S4U）。抗S-IgG和抗RBD-IgG持续者有第一次采血抗S-IgG和抗RBD-IgG，涵盖整个队列观察到的水平范围（图3D和S4V）。此外，直接比较持续者和衰减者的初始抗体水平没有显著差异（图3J和L），并且我们发现初始IgG水平与N、S或RBD和疾病症状持续时间之间没有显著关系（图1C）。尽管初始采血水平相似，但与第三次采血样中的衰减者相比，持续者表现出更高的抗SIgG（图3J）和显著更多的抗RBDIgG（图3L），这与持续者的一个独特特征是抗病毒IgG持续产生相一致。这些数据表明，相对持续的抗体产生发生在不同初始IgG水平和缩短病程的个体中。
虽然尚不清楚哪一水平的可测量功能性抗体活性与保护作用相关，但我们探索了第一次和第三次采血之间抗体衰减动力学差异的潜在功能后果（图S5）。SARS-CoV-2抗体中和的一个主要机制是抑制S与血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合，ACE2是SARS-CoV-2的受体（Hoffmannetal.,）。ACE2结合抑制试验表明，虽然持续者的初始抑制活性低于衰减者，但通过第三次采血无法区分它们（图S5A和S5B）。与此相关，持续者具有较高的ACE2抑制持久性指数（图S5A和S5B），表明抗体反应的整体稳定性与更稳定的功能活性相关。我们还使用自动化高通量假病毒中和试验和传统的假病毒中和试验（图S5C）来测量SARS-CoV-2中和活性的稳定性。中和效价与年龄和疾病严重程度呈正相关，与总抗体水平相似（图S5D）。与ELISA抗体测量值和ACE2-抑制水平相比，在第一和第三次的样本中，50%中和滴度（NT50）在所有受试者之间紧密聚集，在这些时间点上，没有证据表明持续者和衰减者之间在数量或耐久性动态方面存在差异（图S5F-I）。根据NT50水平随时间的差异来区分受试者的能力受到限制，这可能是由于与其他抗体测量值相比，接近检测极限的值范围很小（图S5E）。在这方面，只有在初始中和效价较高的个体中，才能观察到第1次和第3次采血之间NT50的显著下降（图S5C）。
抗体持续者初始CD4+T细胞减少，记忆B细胞体细胞突变增加
为了进一步探索快速愈合抗体持续表型的特征，我们使用先前建立的T细胞表型策略对CD4+（图4）和CD8+（图S6）T细胞群进行了特征分析（Mathewetal.,）。我们观察到，持续者在第一次采血和几个月后的第三次采血中都有更高频率的记忆CD4+T细胞。CD8+T细胞群无明显差异。这些数据表明，那些从轻度COVID-19中快速痊愈的人，在CD4+T细胞亚群中存在差异，在疾病治愈后仍然持续存在。
我们还对S-特异性单记忆B细胞进行了流式细胞术分类，并对其Ig基因进行测序以评估SHM。根据CD20和CD38的表达，我们确认S-特异性记忆细胞不是浆细胞（图S7A-C）。我们根据相似的初始抗体水平选择了12个持续者和13个衰减者（图S7J和K）。这些受试者的临床和抗体特征表明，他们可以作为每一组的代表（图S7D-Q），并且他们具有相似的S-特异性记忆细胞频率（图5A和B）。我们观察到在从第一次采血中分离出的持续者克隆中IgH-V基因片段（VH）突变显著增高（图5C）。我们发现，19.4%的第一次采血持续者克隆有15个以上的突变（前10个百分点），而只有4.2%的衰减者克隆有15个以上的突变（图5D）。我们还发现，少于15个突变的持续者衍生克隆的第一次采血突变频率也明显较高（图S7R）。在第三次采血时（图5C和D），持续者和衰减者之间突变频率的差异缩小了，因为两组在采血3次时都获得了显著更多的突变。轻链V基因（VL）突变与VH结果基本一致（图5E和F）。两组之间未观察到VH基因片段的使用率差异（图6G）。这些数据表明，恢复后早期增加病毒特异性记忆B细胞可能是一个独特的持续者特征，并且抗SARS-CoV-2记忆B细胞的持续进化发生在恢复期更晚的时候。
天持续性病毒特异性IgG的产生可以预测抗体到天的持续存在
68名受试者进行了第4次抽血，其中64名受试者出现SARS-CoV-2血清转化（图6）。第4次取样使我们能够测试（i）抗体在持续者中是否保持持久性，以及（ii）这种持久性是否转化为症状出现后约天的更高抗体水平（图6A）。在这项分析中，我们继续根据第3次采血时计算的抗体持久性指数对受试者进行分类（图6B），并测量第四次抽血样本的总抗体水平、ACE2结合抑制和假病毒中和（图6C和D）。我们用受试者的第四次采血得到的值除以他们的第一次时的测量值，计算出此时的持久性指数。在第3次和第4次采血之间约1个月的相对较短时间内，与衰减者相比，持续者的抗-S和抗-RBD-IgG的绝对值显著增加。持续者的总抗体持久性指数也显著高于衰减者。此外，在图4中，抗S-IgG持续者具有显著更高的中和抗体（图6C），并且抗S和抗RBD持续者在图4中显示出显著更高的ACE2结合抑制持久性指数。
我们通过第四次和第一次IgG的比值将受试者分组为持续者或衰减者，与第三次采血后得到的组进行了比较（图7A）。我们发现在两者有相当大的重合（图7B）。关键的临床相关性，即缩短的症状持续时间，也在第四次采血后被归类为持续者中观察到（图7C和D）。我们还观察到第四次采血后持续者（图7E和F）的总抗体水平、中和和耐久性指数与第三次采血后定义的持续者（图6C和D）的相似差异。这些数据共同支持了病毒特异性IgG持续产生与疾病持续时间更短之间相关的这个结论。数据还表明，尽管初始抗体水平有很大的不同，但与衰减者相比，IgG维持者整体上拥有更大的抗体量。
讨论
我们得到的研究结果的一个重要意义是可能存在一种有效的SARS-CoV-2病毒“处理者”（handler）表型，定义为经历与相对持续的抗SARS-CoV-2IgG产生相关的COVID-19快速恢复个体。基于GCs对LLPCs和SHM积累的需求，这表明在生理GC反应中，“持续者”表型可能包括淋巴细胞相互作用的相对最佳协调。在这方面，GC失调和短暂抗体反应可能不是COVID-19的必然结果。在那些快速痊愈并维持抗体产生的患者中，升高的CD4+效应记忆T细胞的百分比，增加了一种独特的免疫表型的支持，与疾病更快痊愈相关。持续者中效应记忆T细胞百分比的增加是否反映了CD4+效应记忆分化的增加，或者是与持续者COVID-19后遗症有关，还有待进一步研究。有效的痊愈者表型在多大程度上是由固有的宿主差异或先前的免疫启动引起的，也需要进一步的研究。
如上所述，增强的SHM似乎不需要强大的抗体中和功能。因此，我们认为持续者早期SHM水平的升高不太可能直接导致症状的快速清除，尽管我们还没有排除这一可能性。相反，我们认为维持者体内SHM升高和持久抗体产生是一种优越的整体免疫过程的结果，总体而言，这种免疫过程是更快痊愈的原因。作为持续者免疫过程的一部分，我们假设在最初的感染过程中，对最佳GC反应的抑制减少，从而导致LLPC的分化。为何持续者能更快地痊愈，这是否与他们为何能够维持病毒特异性IgG的产生有关，这可能是通过保护GCs免受感染介导的失调/抑制而起作用的。理解此队列中抗体耐久性减弱与增强的具体驱动因素，可能会为SARS-CoV-2的保护相关性提供见解，并可能阐明增强有效清除和更持久抗体保护的靶向途径。
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论文原文刊载于CellPress细胞出版社旗下期刊Cell上，点击“阅读原文”或扫描下方