前言
年以来，新型冠状病毒（SARS-CoV-2）肆虐人间，给人类社会带来了巨大的灾难。在过去的两年时间里，新冠病毒在数亿人体内进行了无数次的复制、变异和进化，特别是最近被世界卫生组织命名为“奥密克戎”的新冠病毒变异株，更是凭借在关键蛋白上的30多个突变氨基酸具备超强的传播性，一经问世便在全世界范围内快速蔓延，再次引起了人们对于新冠病毒的恐慌。全世界科学家一直都在想法设法研究对抗战胜新冠病毒的方案，控制新冠病毒的传播，在抗击新冠病毒的过程中，特别是在新冠疫苗的研发中，合成生物学发挥了举足轻重的作用。
1.新型冠状病毒介绍
目前在全世界流行的新型冠状病毒肺炎（COVID－19）给人类社会带来了巨大灾难。新冠肺炎是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染所引发的，它是年新发现的一种冠状病毒。冠状病毒是有包膜的单股正链ＲNA病毒，形状大多呈球形，直径约60—nm，其包膜上具有规则排列的棘状突起，形状类似皇冠，故名冠状病毒。新型冠状病毒的核酸链是目前已知的RNA病毒中最长的，其基因组除了包含相关的酶基因外，还包含各种结构蛋白的编码基因，主要有编码位于包膜上的纤突蛋白(spikeprotein，S蛋白)、膜蛋白(membraneprotein，M蛋白)、包膜蛋白(envelopeprotein，E蛋白)基因和编码与病毒ＲNA紧密结合的核蛋白(nucleocapsidprotein，N蛋白)基因。S蛋白含有宿主细胞受体识别位点，是介导病毒入侵和决定病毒感染种属与组织特异性的因子;E蛋白和M蛋白主要参与病毒的装配过程;N蛋白包裹基因组形成核蛋白复合体。
由于目前尚未找到对新冠肺炎有确切疗效的药物，所以尽快研发出针对新冠病毒的疫苗是控制疫情传播最有效的手段。根据技术路径不同，目前新冠疫苗研发的主要策略有灭活疫苗、减毒活疫苗、腺病毒载体疫苗、重组蛋白疫苗、核酸疫苗等。
2.基于合成生物学方法研究冠状病毒的历史回顾
2年，美国科学家人工合成脊髓灰质炎病毒，此研究证明通过合成生物学方法可以产生具有感染性的病毒。
5年，加拿大、美国和日本科学家在阿拉斯加冻土中一个死于流感的人的肺组织中发现了引发年大流行的流感病毒(该病毒曾经致使全球0万到万人丧生)的5个基因,并根据这些基因的信息合成了新的流感病毒，结果发现其致病性与西班牙亚型流感病毒相近。
年，荷兰病毒学家利用合成生物学方法研究发现一些突变会使H5N1禽流感病毒在哺乳动物雪貂间更容易传播。
3年，SARS-CoV是一种会引起重度肺炎的冠状病毒，导致全球约人死亡。年美国科学家巴里克实验室通过合成生物学方法构建了一种含有中华菊头蝠SHC冠状病毒表面蛋白的新冠状病毒，结果发现该病毒能让小鼠感染上SARS，证实了蝙蝠携带的冠状病毒可能无需中间宿主就能感染人类。
年，随着COVID-19疫情暴发，美国科学家利用反向遗传合成SARS-CoV-2的策略,并且发现克隆来源的SARS-CoV-2表现出与临床分离株相似的噬菌斑形态、病毒RNA谱和复制动力学。同年5月，瑞士科学家报道通过合成基因组平台可合成新型冠状病毒SARS-CoV-2和其它RNA病毒，这种全合成技术能够在一周之内生产或改造出大量病毒活体,以供医疗和研究机构使用。
通过合成生物学方法研究冠状病毒，有助于加速阐明病毒致病机理或药物和疫苗的研发，为疾病的预防和控制提供科学依据和技术方法。
3.基于合成生物学的疫苗开发
疫苗是公共卫生的重要组成部分，有助于降低多种疾病的发病率和死亡率。疫苗开发需要两个主要步骤：（1）选择特定抗原；（2）将抗原输送到体内。目前的疫苗是使用完整的（灭活或减活疫苗）微生物、病毒或者选定成分通过不同方法引入人体。遗传学、生物化学、结构生物学和生物信息学方面的创新使疫苗设计和生产取得了重大进展，但仍面临许多挑战。接下来，我们将讨论合成生物学如何帮助解决这些问题。我们重点介绍以大规模核酸操作为中心的合成生物学方法和技术，这些方法和技术已成功应用于已获批准或正在临床试验的新冠病毒疫苗的研制，例如：基因组密码子去优化疫苗、DNA和RNA疫苗。
图2：合成生物学与疫苗设计（来源：cell）3.1基因组密码子去优化疫苗
低成本核酸合成技术的出现使合成生物学家能够通过大规模同义突变设计病毒基因组。这种病毒衰减的方法利用了三联体密码子的简并性以及许多物种的特定密码子、密码子对和二核苷酸。目前，可以在不详细了解病毒功能前提下，使用未表达的密码子和密码子来减少人类细胞中病毒蛋白的产生（图2）。这个过程最初是用来开发减毒脊髓灰质炎的病毒株。尽管突变的病毒仍具有传染性，但其毒性大大减弱，且大多数突变在25次传代后保持稳定。
密码子去优化疫苗最大的好处就是速度快，该方法不需要详细了解病毒功能，设计一个去优化基因组需要3-5天，基因组合成、细胞系测试到临床应用可在48天内完成。密码子去优化疫苗也有一些缺点，该方法产生的减毒病毒与其他活病毒需要相同的存储、处理和冷藏要求，同时需要权衡每种病毒的最佳突变负荷。密码子去优化疫苗已在几个I期临床试验中使用，包括CodaVax-H1N（针对甲型H1N1流感的减活疫苗，以注射和鼻腔喷雾剂形式使用）、CodaVaxRSV（抗呼吸道合胞病毒活疫苗）、CDX-（计划于年初进行I期临床试验的SARS-CoV-2减活疫苗）等。
3.2DNA疫苗
核酸疫苗的前提是将编码病毒成分的DNA或RNA引入人体细胞，产生自然感染过程的病毒抗原肽诱导细胞和体液免疫。核酸疫苗的优点是设计速度快、生产过程简单。几乎所有的蛋白表位都可以作为靶点，但其基因组的大小影响生产成本、输送效率（大多数疫苗在5-12kb）。新冠病毒（SARS-CoV-2）基因组是30kb，需要已有的生物学知识对其进行表位选择。一旦获得基因组序列，就可以设计、制造核酸疫苗，并在数周内开始试验。
与早期的RNA制剂相比，DNA疫苗因其具有更强的稳定性和能减少非特异性炎症而备受青睐（图2）。DNA疫苗的最大优点之一就是热稳定性比较高，例如，基于DNA的埃博拉糖蛋白疫苗INO在37°C可存放1个月，25°C可存放1年，4°C可存放3年。另一个潜在的好处是在啮齿动物肌肉注射后可以延长抗原表达。然而，在早期人体试验中，DNA疫苗受到免疫原性较弱、需要体内电穿孔以促进核内递送以及不良基因组整合事件风险的限制。现在的DNA疫苗通过密码子优化、简化质粒、抗双链DNA（dsDNA）设计以及无需电穿孔的无针肌内注射等方式提高了免疫原性。目前，通过电穿孔递送的表达新冠病毒蛋白的DNA疫苗INO-4正在进行II期临床试验，它是唯一一种可以在室温条件下稳定储存超过一年的核酸疫苗药物，因而其在运输或储存期间不需要冷冻操作，这是进行大规模免疫接种时所需考虑的一个至关重要的因素（图3）。
图3：DNA疫苗作用机理注：DNA疫苗肌肉注射，它首先分别作用于主要的肌细胞和角化细胞，同时作用于近注射侧的抗原呈递细胞（APC）。在DNA疫苗的作用下，内化后DNA需要在细胞核内转录，随后在细胞质翻译
3.3RNA疫苗
RNA不如DNA稳定，很容易被外界环境和细胞内的核酸酶降解，RNA疫苗面临的最大挑战就是如何将完整的核酸链递送到人体细胞内。目前，大多数疫苗制造商通过材料化学和脂质纳米颗粒（NPs）来浓缩、保护和增强RNA在细胞内的传递。RNA疫苗注入人体细胞后面临的另一个挑战就是抗原蛋白表达的稳定性，这也是最大限度地诱导免疫应答所必需的，人体内的防御机制可以识别外源性RNA以诱导RNA的降解，这些都会降低RNA疫苗的靶向免疫。
目前，合成生物学方法已经应用于提高疫苗RNA在细胞内的稳定性、降低细胞毒性、提高蛋白质生产等方面。利用合成生物学提高RNA稳定性和翻译效率的主要方法是工程化改造RNA结构或碱基组成，RNA结构上的改造比较常见的就是在RNA上新增一个完整的5’端帽子结构Cap1、增加模块化的5’端非编码区（UTRs）和3’端非编码区，以增强翻译和mRNA稳定，并进一步减少磷酸酶使用（图2）。对mRNA碱基组成的修饰可抑制先天免疫识别、减少细胞毒性并增强抗原的产生。例如Moderna和BioNTech公司使用假尿苷、N-1-甲基假
尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基胞苷等合成了能规避先天免疫效应物的mRNA。CureVac公司利用全转录工程，即用同义密码子替换开放阅读框（ORF）密码子，使GC含量最大化，可在与优化的5’端和3’端非编码区匹配时，显著提高蛋白质的产量。基于RNA的新冠候选ModernamRNA-使用修饰过的核苷编码跨膜锚定全长刺突蛋白（图4）。在I期试验（NCT）中，ModernamRNA-耐受性良好，并产生抗新冠病毒刺突蛋白中和抗体。年11月16日，Moderna公布新冠疫苗三期试验数据，保护效力达到94.5％。
图4:RNA疫苗作用机理（来源：google）注：mRNA疫苗引入编码疾病特异性抗原的mRNA，利用宿主细胞的蛋白质合成机制产生抗原，从而触发免疫应答。
结语
合成生物学作为一门新兴学科，在过去几十年里取得了巨大进展。病毒肆虐的今天，SARS-CoV、MERS-CoV和-nCoV等冠状病毒给世界各国公共卫生和临床救治带来巨大困难和挑战，正在不断威胁着人类的健康。随着全球人群的流动性越来越大，疫情传播速度极快，疫情防控迫在眉睫，当前疫情防控环节最关键的步骤就是研制有效的应急疫苗，阻断新冠病毒传播。而合成生物学在疫苗研制方面为研究人员提供了更广的空间：在疫苗的形式方面，可以设计成纳米颗粒，以增强其免疫原性；在疫苗递送方面，改进旧有的递送载体，使其呈现出最理想递送效果和绝对的安全性；从疫苗的研制效率方面，大大缩短疫苗研发生产的时间。总之，我们有理由相信，合成生物学将会在抗击新冠病毒的过程中发挥出越来越重要的作用，对生物医学的发展也会产生久远的影响。
参考文献
[1]袁盛凌,王艳春,刘纯杰.合成生物学助力应急疫苗研制[J].生物技术通讯,,28(01):44-49.
[2]曾小美,翁俊,苏莉.基于合成生物学方法研究冠状病毒的生物安全思考[J].中华实验和临床病毒学杂志,,35(01):18-21.
[3]HobernikD.,BrosM.,DNAVaccines-HowFarFromClinicalUse?[J].IntJMolSci,,19.
[4]TanX.,LetendreJ.H.,CollinsJ.Jetal.Syntheticbiologyintheclinic:engineeringvaccines,diagnostics,andtherapeutics.[J].Cell,,:-.
[5]Jackson,L.A.,Anderson,E.J.,Rouphael,N.G.,Roberts,P.C.,Makhene,M.,Coler,R.N.,McCullough,M.P.,Chappell,J.D.,Denison,M.R.,Stevens,L.J.,etal.;mRNA-StudyGroup(a).AnmRNAVaccineagainstSARSCoV-2-PreliminaryReport.N.Engl.J.Med.,–.
[6]Anderson,E.J.,Rouphael,N.G.,Widge,A.T.,Jackson,L.A.,Roberts,P.C.,Makhene,M.,Chappell,J.D.,Denison,M.R.,Stevens,L.J.,Pruijssers,A.J.,etal.().SafetyandImmunogenicityofSARS-CoV-2mRNA-VaccineinOlderAdults.N.Engl.J.Med17,–.
[7]Smith,T.R.F.,Patel,A.,Ramos,S.,Elwood,D.,Zhu,X.,Yan,J.,Gary,E.N.,Walker,S.N.,Schultheis,K.,Purwar,M.,etal.().ImmunogenicityofaDNAvaccinecandidateforCOVID-19.Nat.Commun.11,.