#哪些疾病属于乙类传染病#
新冠疫情（COVID-19）加快了疫苗的发展，其中mRNA（messengerRNA）技术处于最前沿。mRNA疫苗从被质疑到成功用于临床，无论是制剂开发还是制备工艺都实现了质的突破，在疫苗历史上写下了浓墨重彩的一笔。今天给大家分享一篇发表在NatureReviews.DrugDiscovery的综述，文章深度总结了mRNA疫苗在传染病领域的技术基础，重点介绍了纳米脂质体（LNPs,lipidnanoparticles）和其他非病毒递送系统（non-viraldeliveryvehicles），同时讨论了mRNA疫苗在实际应用中面临的关键问题。
一、mRNA设计和合成原理
与内源性mRNA结构类似，体外转录（IVT，InVitroTranscription）合成的mRNA包括五个部分：5’cap（帽结构）、5’UTR（非编码区域）、ORF（编码抗原的开放阅读框）、3?UTR和3’polyA尾（多聚腺苷酸尾）。自扩增mRNA是mRNA的一种变体，包含病毒复制相关基因，可实现细胞内mRNA的扩增，导致低剂量mRNA也可表达大量抗原。
图1：mRNA结构示意图
mRNA的5’端帽结构，可防止其被病毒RNA细胞质传感器识别，同时保护mRNA不被外切酶降解，并与3’端的polyA尾、polyA结合蛋白和翻译起始因子蛋白协同作用，启动蛋白质的合成。poly(A)尾的长度间接调节mRNA的翻译和半衰期，为保留poly(A)尾与结合蛋白相互作用、形成启动翻译所必需的复合物、保护帽结构不被降解的功能，足够的长度（–bp）是必需的。编码区两侧的5和3UTR调控mRNA的翻译、半衰期和亚细胞定位。高表达基因的天然UTR是合成mRNA的首选，如α-和β-珠蛋白基因。UTR功能可能因细胞类型不同而变化，因此可使用针对靶细胞优化的备选UTR序列。UTR序列的优化可实现mRNA的最小化降解、实现阻止核糖体扫描mRNA转录的区域最小化。mRNA的ORF包含翻译成蛋白质的编码序列，是最关键的组成部分。将稀有密码子替换为编码相同氨基酸残基的常用密码子，可实现开放阅读框的优化。对于某些蛋白质，稀有密码子翻译速率较慢是蛋白质适当折叠所必需的，因此稀有密码子的替换需谨慎。为最大程度地减少不良免疫反应、实现蛋白翻译，mRNA序列通常包含修饰的核苷，如假尿嘧啶、N1-甲基化假尿嘧啶等。未修饰的mRNA可被模式识别受体识别，从而阻断mRNA的翻译。使用修饰后的核苷，特别是修饰后的尿嘌呤，可以避免被模式识别受体识别，进而达到有效的蛋白翻译水平。Moderna和Pfizer-BioNTech生产的COVID-19疫苗包含核苷酸修饰的mRNA。CureVac开发了另一种避免被模式识别受体识别的策略，使用序列工程和密码子优化，通过提高mRNA疫苗的GC含量来减少尿嘧啶。除mRNA序列的改进外，mRNA生产工艺也取得了重大进展。实验室或工业化阶段利用RNA聚合酶T7（或T3/SP6聚合酶），通过体外转录制备mRNA。基于CleanCap共转录加帽的方法，引入2’-O位甲基化的帽结构，随后去除双链RNA、反应物和不完整转录产物得到纯化的mRNA。另一种加帽方法是转录后加帽，使用牛痘病毒加帽酶和2’-O-甲基转移酶完成加帽。在DNA模板中加入poly(A)尾，可简化工艺过程、节省时间、减少产物损失。相较于poly(A)聚合酶催化而成的多腺苷酸化，在DNA质粒中加入poly(A)尾序列克服了尾长度的变异性。但编码poly(A)片段的DNA序列会破坏DNA质粒的稳定性，可以通过在poly(A)尾部添加一个短的UGC连接体（UGClinker）解决这一问题，Pfizer公司的SARS-CoV-2疫苗BNTb2添加了10bp的UGC连接体。
二、mRNA疫苗的递送载体
由于mRNA分子较大（–Da），且带负电荷，无法通过细胞膜阴离子脂质双分子层。此外，mRNA在体内易被自身免疫系统的细胞吞噬，并被核酸酶降解。通过各种技术，包括电穿孔、基因枪和体外转染可以实现mRNA的胞内传递。然而，体内应用时需使用mRNA递送载体，且转染免疫细胞时不会引起毒性或不必要的免疫原性。现已开发出多种基于创新材料的解决方案。比如纳米脂质体、聚合物颗粒、其他阳离子纳米颗粒。
纳米脂质体纳米脂质体（LNPs,lipidnanoparticles）是临床上最前沿的mRNA载体。截至年6月，所有正在研发或获批临床的SARS-CoV-2mRNA疫苗均采用纳米脂质体LNPs。LNPs作为mRNA的递送载体有以下优点：制剂简单、模块化、生物相容性好和较大的mRNA有效载荷容量。除RNA药物外，LNPs通常包括四个组分：可电离脂质（ionizablelipid）、胆固醇（cholesterol）、辅助磷脂（helperphospholipid）和聚乙二醇化脂质（PEGylatedlipid）。可电离脂质体在生理pH下是中性的，在酸性条件下与mRNA形成纳米颗粒，脂质体带正电荷并吸引RNA。且在酸性环境下带正电荷，促进与细胞膜间的融合，并释放至细胞质。胆固醇通过填充脂质之间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，细胞吸收时有助于与内体膜融合。辅助性脂质通过促进脂质相变来调节纳米颗粒的流动性并增强疗效，有助于膜与核内物质的融合。聚乙二醇化脂质由聚乙二醇（PEG）与锚定脂质（如DMPE或DMG）结合而成。亲水性PEG稳定LNP，通过限制脂质融合调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用增加纳米颗粒的半衰期。
聚合物和聚合物纳米颗粒尽管聚合物（polyplexes）和聚合物纳米颗粒（polymericnanoparticles）的临床进展不如LNPs，但聚合物具有与脂质体类似的优势，并能有效递送mRNA。阳离子聚合物将核酸浓缩成不同形状和大小的复合物，可通过内吞作用进入细胞。与LNP中的可电离脂质体类似，pH依赖型的聚合物也可用于mRNA的递送。在体内酸性pH下，与可电离的氨基乙烯侧链共轭结合的聚（天冬酰胺）发生质子化，促进RNA的递送。
其他递送系统基于多肽主链和侧链中的阳离子或两性氨基（例如精氨酸）与mRNA的静电结合效应，多肽（peptides）也可作为mRNA的递送载体。阳离子纳米乳（cationicnanoemulsions）可通过将mRNA吸附在其表面，发挥药物递送功能。
三、mRNA疫苗在传染病领域的应用
当前，传染病疫苗是mRNA疗法最前沿的应用。大多数正在进行的临床前试验和临床使用的mRNA疫苗都是以推注的形式注射到皮肤、肌肉或皮下腔，从而被免疫或非免疫细胞吸收并转化为抗原，呈递给T细胞和B细胞。mRNA疫苗激活免疫反应的过程如下图所示：①mRNA疫苗注射到人体后被抗原呈递细胞（antigen-presentingcells）内吞；②mRNA进入胞质后，由核糖体翻译成抗原蛋白，通过多种方式刺激免疫系统；③细胞内抗原被蛋白酶复合体分解成小片段，通过主要组织相容性复合体（MHC）I类分子运送到细胞表面呈递给CD8T细胞；④活化的CD8T细胞通过分泌溶细胞蛋白，如穿孔素、颗粒酶等杀死感染细胞；⑤分泌的抗原可被细胞吸收并在体内降解，通过MHCII类蛋白运送至细胞表面呈递给CD4T细胞；⑥CD4T细胞通过刺激B细胞产生抗体，与病原体结合，并通过炎性细胞因子激活吞噬细胞，完成病原体的清除。图2：mRNA疫苗转染抗原呈递细胞诱发免疫反应
目前有多款mRNA疫苗处于开发阶段，如下图所示，目标编码蛋白包括SARS-CoV-2刺突蛋白（S蛋白）及其受体结合区域（RBD）、流感病毒血凝素蛋白和核蛋白、寨卡病毒膜和包膜蛋白、HIV表面糖蛋白保守区域、呼吸道合胞病毒融合蛋白、埃博拉病毒糖蛋白、狂犬病病毒糖蛋白等。
图3：正在开发的mRNA疫苗及其目标编码蛋白
四、关键问题
抗体反应持续时间接种疫苗后，翻译的抗原被抗原呈递细胞产生或吸收，并运送至淋巴结，淋巴结中B细胞、抗原呈递细胞和滤泡辅助性T细胞（TFH细胞）相互作用促进生发中心的形成，生发中心B细胞增殖、分化、抗体基因变异以产生高亲和性的中性抗体。为达到持久的抗体反应，生发中心反应和TFH细胞诱导至关重要，可维持数月或数年的保护效力。为了增强免疫反应的第一步，有些递送系统通过抗原呈递细胞来翻译mRNA。主动靶向抗原呈递细胞的潜在策略包括：将单克隆抗体（mAbs）与LNP表面共轭、树突状细胞特异性配体修饰LNP表面、调整LNPs的物理性质（如表面电荷）。此外，通过延长抗原mRNA的翻译来改变疫苗的药代动力学已经成为一种潜在增强抗体反应的策略。针对病毒新变体的疫苗病毒基因组的复制过程中常发生突变，尽管大多数突变对病毒的功能影响很小或没有影响，但一些突变可以增强免疫逃逸。30多年来，艾滋病毒的快速突变阻碍了有效疫苗的开发；为应对流感病毒的突变，需要每年对疫苗成分进行调整，以靶向优势毒株。针对变异病毒的新策略包括靶向保守区域的mRNA疫苗，或编码广谱性中和抗体。安全性总的来说，mRNA疫苗具有良好的安全性，在临床试验中仅报告了轻中度不良事件。然而，也存在一些零星事件要求进一步优化mRNA抗原和递送制剂。与大多数药物一样，mRNA疫苗的不良反应随剂量递增而增加。接种辉瑞COVID-19mRNA疫苗的人群中，每百万人约有4.7人发生过敏反应，而接种Moderna疫苗的人群中，每百万人约有2.5人出现过敏反应，过敏发生率约为传统疫苗的2-4倍。一种猜想是，过敏反应归因于自身存在的抗聚乙二醇化脂质抗体。作为一个新的药物领域，仍需深入地探索mRNA疫苗引起过敏反应的机制，以便重新设计以改善安全性。
五、展望
近年来mRNA设计和核酸递送技术的发展、以及新抗原靶点的发现，使mRNA疫苗成为抗击传染病的一种有利工具。SARS-CoV-2爆发以来，mRNA疫苗实现了突破性进展，开发速度及临床表现远超预期。LNPs和RNA治疗从罕见疾病市场发展至广泛人群的疾病预防，产生了大量积极的安全性和疗效数据，mRNA疗法在疫苗接种、癌症免疫治疗、蛋白质替代治疗等领域将大有可为！
为快速推进mRNA的研发进程，耀海生物推出以下mRNA预制品：mRNA-（Moderna·S蛋白全长）、mRNA-b2（辉瑞·S蛋白全长）、mRNA-eGFP（增强绿色荧光蛋白）和mRNA-luciferase（细菌荧光素酶），可在3-7个工作日内完成交付（由于RNA稳定性不高，公司采用现货生产）。
为满足广大客户的定制化合成需求，耀海生物可提供序列设计、转录模板制备、体外转录、mRNA纯化的一站式服务，具备以下特色：1)建立了天然UTR库，提供多元化的UTR来源选择，可针对不同品种匹配合适的UTR序列；可对天然5’UTR进行优化改造；2)采用国际前沿的设计策略优化终止密码子、PolyA尾等结构；3)多样化的核苷酸修饰，以有效降低免疫原性；4)高产稳定的加帽工艺，包括酶法加帽和共转录加帽；5)成熟完善的纯化平台，LiCl沉淀、磁珠纯化和层析纯化，可有效去除mRNA制备过程产生的各种杂质（层析纯化方案由耀海生物完全自主开发）；6)可满足10,nt以内的定制化mRNA制备需求；7)交付周期短，最快7个工作日内交付。
参考文献：
ChaudharyN,WeissmanD,WhiteheadKA.mRNAvaccinesforinfectiousdiseases:principles,deliveryandclinicaltranslation.NatRevDrugDiscov.Nov;20(11):-.doi:10./s---5.