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章台柳
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胃肠道类器官技术已经成为研究器官发育、功能和疾病的独特的体外模型，但是该技术标准化过程存在困难，导致类器官技术尚未广泛应用于药物开发或诊断。由于类器官需要在凝固态的Matrigel中生长，其物理参数和生长因子浓度的局部差异可能导致类器官的形状、大小和分布具有差异，导致检测技术的研发变得困难。此外，由于单个3D生长的类器官位于不同的聚焦平面，利用成像技术提取类器官的定量数据非常具有挑战。
研究人员尝试对胃肠道类器官技术进行改进使之应用于筛选分析，使用聚（苯乙烯）涂层聚（二甲基硅氧烷）（PDMS）材质的微孔基底或在基质Matrigel的平坦层上培养类器官。前一种方法非常适合高通量克隆培养和随后的单个类器官分析，如用qPCR进行下游分析，但其依赖于非生理性聚合物底物，将会损伤类器官的发育，因此限制了它的适用范围。后一种方法在某些情况下形成Matrigel-中间层-Matrigel形成“三明治”结构，可以产生类器官阵列，并可随时间的推移进行成像和跟踪。然而，由于类器官的发育是随机的，所以该方法的通量较低（大约每平方毫米4个类器官）、重复性较差。在规模化、形态发生的稳定性以及高通量的表型分析的相容性上，需要进一步研究优化。
年6月8日，瑞士洛桑联邦理工学院EPFL的MatthiasP.Lutolf在NatureBiomedicalEngineering上发表了题为High-throughputautomatedorganoidcultureviastem-cellaggregationinmicrocavityarrays的文章，研发了微型工程细胞培养装置，实现了利用聚合物-水凝胶基质的微腔阵列中对数千个胃肠道类器官的悬浮培养和实时分析的可扩展自动化技术。利用该装置培养小鼠和人胃肠道类器官，发现由于不使用固体基质，培养的类器官的不均一性大大减少。此外，利用该设备可实现利用患者来源的结直肠癌类器官对抗癌候选药物进行筛选，并应用基于图像的表型分析揭示药物作用机制。
研究人员设计了一种微型工程水凝胶基质构成一系列规则间隔的圆形底部微腔，主要根据三个设计标准构思：1）类器官培养起始时，单个微腔可促进上皮（干）细胞的快速聚集，这个作为体外类器官培养的起始材料，对于建立均一大小的极化的上皮组织至关重要；2）单个的微腔可稳定地圈住类器官，有助于其有效发育成一个规则的类器官阵列；3）通过提供几何和微环境信号，微腔可作为人工微环境，引导上皮干细胞细胞聚集成类器官。
随后，基于软光刻技术结合复制模塑，直接在传统塑料或玻璃细胞培养器表面制造水凝胶微腔阵列。选用聚乙二醇（PEG）水凝胶，扫描电子显微镜（SEM）显示PEG水凝胶膜可以很容易地模制成完美的U型微腔阵列。微腔的直径、深度和间距可自由选择，以适应不同大小和复杂度的发育组织。通过改变PEG预聚物的浓度可在相对较宽的范围内（30-kDa）精确地调节水凝胶基底的刚度，不会导致微结构特征的任何变形。通过将理想的生物活性配体与与其他惰性凝胶网络共轭，或通过向微腔填充天然或合成基质来定制水凝胶基底的生物化学性质。
研究人员使用Lgr5-eGFP+小鼠肠干细胞（ISCs）进行类器官的构建。基于肠类器官直径大约um，选择了um微腔进行类器官培养，每个微腔种入个细胞。30min内，细胞沉淀到微腔底部，形成紧密的、形状不规则的SC群落；24h内，ISC聚集物变得平滑，形成尖周（apicobasally，AP）极化柱状上皮组织；60h时转换成分化培养基，诱导隐窝绒毛的形态发生，从而产生一系列具有一个或多个隐窝状芽的mini-guts。成像分析显示，干细胞扩增初期，AP极化的上皮组织是由eGFP+SC组成，诱导分化后，eGFP+SC被限制在芽内。
免疫荧光显示类器官中含有小鼠小肠中主要的上皮细胞类型，包括肠上皮细胞、Paneth细胞、肠内分泌细胞和杯状细胞。而且，约92±4%的细胞聚集体都发育成管腔化的mini-guts。进一步分析显示，种入微腔的初始细胞数对类器官的发育有影响。个和个细胞的生长模式类似，但50个细胞或更少可形成AP极化SC克隆，但是不能发生出芽，少于10个细胞则生存较差，不能产生上皮结构。培养1-3天，SC克隆的大小分布比较均一；4天后，分化诱导的出芽导致大小分布差异增大。此外，微腔的直径和微腔单位表面积的密度直接影响肠类器官的寿命。个微腔直径um培养液ul的条件下，类器官最多维持8天；而31个微腔um直径的条件下，类器官可维持16天。微腔捕获类器官非常稳定，在长达10次培养液的更换下，所有类器官的损失不到0.5%。
细胞培养的均一性和可重复性是药物研发和诊断中基于细胞的分析实验中重要条件。研究人员以下对4种条件生长的肠类器官进行对比：1）Matrigel上单细胞；2）Matrigel上完整的隐窝片段；3）微腔阵列上未分选的单细胞聚集体（包含ISCs和Paneth细胞）；4）微腔阵列上GFP分选的单细胞聚集体。通过对比所培养类器官的数量、大小分布、均一性等，表明聚集性ISCs是高效快速生长类器官的最佳初始条件。这一策略可以绕过干细胞的扩张阶段，避免从单个干细胞到生成形成肠类器官所需要的细胞数目这一过程，从而大大提高了速度。并且，这一过程可实现自动化操作，所形成类器官的效率和质量与手工操作没有显著差异。
最后，研究人员从手术切除的原位结直肠癌（CRC）样本培养出CRC类器官，从人结肠癌细胞系（HCT）培养出球状体，对FDA批准或临床试验中的80种化合物进行测试。药物处理后，使用高通量成像技术进行分析，肿瘤类器官对化疗和表皮生长因子受体抑制剂的敏感性高于球状体，这与原位肿瘤没有KRAS突变，而HCT细胞系存在突变体有关。
主成分分析发现三个强表型异常值，Orantinib、Vindesine和Afuresertib，其中AKT抑制剂Afursertib添加后48h-72h可诱导原位囊性肿瘤的肿胀，在HCT球状体没有。20uM的Afursertib具有明显的毒性，IC50为10.67uM，但肿胀表型只在0.3uM到4uM之间的限定窗口可见，其IC50为0.31uM。这些表型在常规筛选方法中无法被观察到。Afursertib对肿瘤类器官的肿胀作用或与参与形态发生、发育和分化的个基因的过表达有关。
总之，研究开发出一套高通量自动化类器官培养的微腔阵列技术，配合成像技术进行表型分析，可实现其在药物筛选和诊断上的应用。该技术大大提升了类器官培养的自动化、可重复性并缩短培养时间，为类器官研究提供新的工具。