GSTpulldown（GST融合蛋白沉降技术）是体外检测蛋白相互作用的常用方法，可验证已知蛋白之间的互作，也可用于筛选与已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便，简单易行。
一、GSTpulldown实验原理
GSTpulldown的主要原理是利用DNA重组技术将已知蛋白与GST融合，而融合蛋白通过GST与固化在载体上的GTH（谷胱甘肽）亲和结合。简单来说，我们假定a蛋白和b蛋白可能存在互作，将纯化的融合GST的a蛋白和纯化的b蛋白以及能特异性结合GST的Sephrose4Bbeads混合在一起孵育一定时间，然后洗去未结合的蛋白，煮沸beads进行SDS-PAGE电泳。通过Westernblot检测结果，我们可以看到GST-a蛋白和b蛋白所对应的条带，即表明了a蛋白和b蛋白因发生相互作用而被GST-apulldown（GST对照只显示一个条带）。
二、GST-a融合蛋白的制备
1．GST-a融合蛋白的表达
(1)将目的蛋白与GST的重组质粒转化到BL21菌株中；
(2)挑取单克隆到含有5mlLB培养基（加入5ul氨苄）的10ml试管里，37℃恒温振荡培养箱中培养过夜；
(3)将培养菌液转移到含有mlLB（含ul氨苄）的1L锥形瓶中，37℃，rpm培养数小时；
(4)测定OD值，当OD达到0.6左右时，加入适当浓度的IPTG，在20℃，rpm条件下培养10-16h（通常需要进行预实验以确定最佳IPTG浓度、诱导温度和时间）；
(5)诱导适当时间后，将菌液分次倒入50ml离心管中，4℃rpm离心10分钟，然后弃去上清，收集管底菌体，如暂时不用，可将菌体保存于-80℃冰箱中；
(6)先加入少量PBS于离心管中，离心5-10min后弃去上清，再按每10ml菌液沉淀1mlPBS的量加入相应的PBS，涡旋振荡，使菌体沉淀充分溶解于PBS溶液中；
(7)把混合菌体置于冰水浴中，用超声仪进行破碎。每次超声破碎20s，间隔30s（破碎时间、破碎次数和间隔时间视具体情况而定），经过适当时间超声后，溶液会显得澄清；
(8)将超声后的溶液4℃rpm离心10分钟，上清液转移至新的离心管中，-80℃保存备用。
2．GST-a融合蛋白的纯化
(1)在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积50%GlutathioneSepharose4B，4℃摇床上缓慢摇动30~60min;
(2)4℃，rpm离心5min，弃去上清，该Sepharose上结合了GST-a融合蛋白；
(3)加入ul预冷的PBS溶液，轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次，4℃，rpm离心5min，弃去上清，重复此步骤3次；
(4)最后一次用移液枪吸走珠子表面的液体，但注意不要吸走珠子，即可获得结合GST-a的Sepharose。
三、b蛋白的制备
b蛋白可融合His标签进行原核表达，也可融合Flag/HA/Myc等标签进行真核表达。
His标签蛋白纯化通常采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）纯化的方法，主要利用介质配体螯合的金属离子吸附纯化表面带组氨酸残基的蛋白。由于His标签可与多种金属离子（如Ca2+、Mg2+、Ni2+、Cu2+，Fe2+等）发生特殊的相互作用，所以可利用蛋白质表面的特性，使之被吸附在凝胶柱上，从而达到分离纯化蛋白的目的。组氨酸的残基上带有1个咪唑基团，可与Ni2+、Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性结合在金属离子上，这些金属离子能够用螯合配体固定在层析介质上，因此带有His标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性结合在介质上，而其他杂质蛋白则不能结合或仅能微弱结合。结合在介质上的His标签蛋白可以通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱，从而得到纯度较高的His标签蛋白。
Ni2+、Co2+和Cu2+是His标签蛋白纯化中使用较为广泛的金属离子，因为它们在水溶液中与组氨酸具有较好的亲和性。其中，Ni2+是亲和纯化实验中最常使用的，根据结合基团不同，Ni2+亲和层析柱可分为两类：一类是Ni-IDA，另一类是Ni-NTA。Ni2+有六个螯合价位，其中Ni-NTA螯合了四价，Ni-IDA螯合了三价。所以，IDA的载量要比NTA高，在同样条件下，Ni-IDA洗脱时所需的咪唑浓度要高于Ni-NTA，但其弱结合能力使金属离子在洗脱时容易浸出，与目的蛋白紧密结合，从而导致分离蛋白产量偏低，产品不纯及金属离子污染等问题。NTA的颗粒粒度均匀，粒径更小，并且螯合镍更稳定，能耐受较高的还原剂，使填料更加稳定，镍离子不易脱落，所以实际实验中往往选择Ni-NTA亲和层析柱进行蛋白纯化。
四、体外蛋白的结合
(1)将结合有GST-a融合蛋白的Sepharose4B悬浮在适量体积的缓冲液中，加入20ul含有b蛋白的溶液，同时采用结合有GST蛋白的Sepharose作为阴性对照，在摇床上晃动4-8h（4℃）；
(2)4℃，rpm离心5min，弃去上清液；
(3)沿壁加入ul预冷的缓冲液对Sepharose进行洗涤，
(4)4℃，rpm离心5min，弃上清，该步骤重复3次；
(5)吸干Sepharose上面的液体后，加入20ul1×蛋白电泳上样缓冲液，沸水浴5min，放入-20℃冰箱备用；
(6)通过SDS-PAGE和Westernblot进行检测。
北京科沿有道生物科技有限公司，专注于生命科学最前沿科研技术服务，具有较好的生物学和医学技术服务平台，能够提供实验课题设计、论文编辑润色，以及细胞实验、动物模型、病理检测、分子实验、免疫检测、病毒包装、组学服务、基因编辑等整体课题一站式服务。
科沿有道秉承“客户为先，服务至上”的经营理念，以一切为了客户的利益为宗旨，努力为广大客户提供最优质、高效的服务，科沿有道人用实实在在的优质实验技术换取客户的信任，相信在未来的工作中，科沿有道人一定能够成为您的得力助手和值得信赖的合作伙伴。