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稳定细胞株作为生物制药CMC的基础工作，一向被重视和瞩目，正所谓“成也萧何，败也萧何”，一个好的细胞株往往能使得后续的工艺开发工作事半功倍，大幅降低抗体/重组蛋白的生产成本；反之则需要花费更多的时间去进行上游工艺的优化和改善，既延长了项目时间，又花费了更多的资金。今天的皓奇星栏目我们便来介绍一下细胞株构建的流程。
CHO细胞历史悠久，并拥有庞大的家族。从年，北京协和医学院的Dr.E.T.Hsieh在北京郊外抓了一些中国仓鼠用作动物模型开始，一直到年12月，由美国医生RobertBriggsWatson在协和医学院的Chengsiang-Hu教授的协助下将20只中国仓鼠赶在南京解放前送到上海，并从上海运送到纽约，最后由VictorSchwentker公司驯养成一种实验室动物品系，中国仓鼠一直作为一种实验室研究用动物模型（想到这里笔者痛心疾首，要不是那时中国处于战乱，自己没有能力保存，也不至于今天被ATCC和ECACC掐住脖子）。后Puck成功分离到了中国仓鼠卵巢细胞并体外培养，在接下来的几十年里CHO细胞家族不断壮大，被广泛应用于生物制药领域。
图1.CHO细胞品系的历史
FlorianM.WurmandMariaJooWurm.CloningofCHOCells,ProductivityandGeneticStability-ADiscussion.
今天不同品系的CHO细胞被用于重组蛋白的表达，其中有代表性的包括：
表1.常用商业化宿主细胞株
不同的宿主细胞在细胞株构建中的表现差异很大，本文仅能从笔者有限的经验中提供一些参考，对于初步涉及细胞株工作的朋友，可以采购商品化的宿主细胞试剂盒，并遵照说明书进行操作，熟悉细胞的特性后，再自行优化筛选方式。各种宿主细胞均有各自优劣，使用者需要考虑包括表达水平、蛋白质量、商业授权等各方面因素，例如优势方面，GS系统下表达量和Qp相对较高，DG44系统细胞株稳定性好，K1筛选周期短且表达量高，CHO-S商业授权清晰；反过来缺点方面GS系统价格昂贵，DG44表达量较低，K1细胞株稳定性较差，CHO-S相对易结团等等。真正有经验的研究人员，则可以根据不同细胞的特性，开发合适的筛选方式和培养工艺，将细胞的潜能挖掘到最大，正如俗语所说“Lessismore”，细胞株构建亦然。
生产用稳定细胞株的构建首先由表达载体的构建和细胞转染开始
将表达抗体的目的基因构建到载体上，再将该载体转染进入宿主细胞内，常见的转染方式主要有钙转、电转、脂质体转染和逆转录病毒转染，DNA进入宿主细胞核后将会随机整合到宿主细胞基因组当中去，因此表达水平与基因拷贝数、基因整合位点的转录活性有关。
接下来不同筛选试剂将被用于筛选能够正确表达目的基因并且高水平表达的细胞群(pool）。
由于此时得到的细胞群中的每个细胞特性各异，具有不同的基因整合位点、拷贝数、细胞单产和生长速率，因此需要将其中具有高产、稳定表达特性的细胞个体分离出来分别培养，通常需要获得数百甚至上千的候选克隆供进一步筛选。
被筛选出来的克隆经过传代培养和分批补料实验(Fed-batch)，比较其生长特性、代谢状况、表达量高低、表达产物质量等，选出最优的几个克隆进入生物反应器放大实验，同步评估细胞株稳定性，最终确定生产用单克隆细胞株。
图2.细胞株构建流程图（以GS系统为例）
SooMinNoh,SeunghyeonShinandGyunMinLee.Comprehensivecharacterizationofglutaminesynthetase-mediatedselectionfortheestablishmentofre