随着新冠病*（SARS-CoV-2）在全球广泛传播，新冠病*变体不断出现。这其中的不少变体不仅拥有更强的传播力和致病性，往往还能在新冠疫苗免疫人群中突破感染，对当前新冠防控提出了巨大挑战。鉴定新冠病*广谱保护性表位、创制广谱免疫保护疫苗及药物迫在眉睫。
与SARS-CoV类似，SARS-CoV-2使用ACE2作为启动感染的细胞受体。在感染过程中，SARS-CoV-2的S蛋白首先被裂解S1和S2亚基；S1亚基的RBD先与ACE2结合，然后S2亚基介导病*与细胞膜的融合。其中，S1亚基抗原突变频繁；S2亚基则较为保守，是极具吸引力的广谱免疫保护靶标。然而，目前S2亚基中的保护性表位尚未被广泛研究。
鉴此，年10月13日，扬州大学兽医学院秦爱建/叶建强团队联合中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高团队，中国农业大学动物医学院刘平*团队以及陆**医大学全*免疫学研究所叶丽林团队等合作在CellularMolecularImmunology杂志上发表文章AnovellinearandbroadlyneutralizingpeptideintheSARS-CoV-2S2proteinforuniversalvaccinedevelopment，利用基于合成肽的ELISA技术，发现一个源于S2亚基的P4多肽（S蛋白的-位氨基酸）与新冠康复病人的血清具有良好的反应性，表明P4多肽携带功能性B细胞抗原表位（图1a）。进一步序列比对发现，P4位于七肽重复序列1（HR1）和七肽重复序列2（HR2）的连接区域，且P4的序列在SARS-CoV、BatCoVRaTG13、SARS-CoV-2以及新近出现的SARS-CoV-2变体（包括B.1.1.7、B.1.1.、B.1.、P.2、P.1、B.1.和B.1..2）中均高度保守（图1b和c）。
HR1和HR2在冠状病*的膜融合过程中扮演着重要角色[7]，故而推测P4是开发基于肽的抑制剂和疫苗的潜在靶点。为了验证该猜想，用KLH-P4偶联多肽免疫小鼠，并获得了4株抗P4多肽的单克隆抗体：B10、C10、E2和G5。通过假病*中和试验发现，单抗B10、C10和G5均能有效中和SARS-CoV-2S蛋白假病*，而单抗E2则不能中和该假病*（图1d）。此外，单抗B10、C10和G5还能有效中和SARS-CoVS蛋白假病*（图1e）。值得注意的是，单抗G5亦可有效中和含新冠南非株B.1.S蛋白的假病*（图1f）。与上述数据一致，单抗B10、C10和G5能中和在VeroE6细胞上野生型新冠病*SARS-CoV-2的感染（图1g）。同时，单抗B10、C10和G5均能有效阻抑rVSV-SARS-CoV2-S-GFP嵌合病*在VeroE6细胞中的扩散，而单抗E2则不能（图1h）。
图1一种源于SARS-CoV-2S2蛋白的新型广谱保护性多肽P4的发现及鉴定
通过构建S2-P4系列截短体和Westernblot试验证明，单抗B10、C10、E2和G5均可有效识别SARS-CoV-2和SARS-CoV的S和S2蛋白（图2a和b），且发现序列YFKNHTSP为这些单抗所识别抗原表位的关键结合位点（图2c和d）。另外，通过免疫沉淀试验发现单抗B10、C10和G5与S2蛋白的亲和力远高于单抗E2。
图2抗P4单克隆抗体B10、C10、E2和G5识别表位的鉴定
为了评价P4是否具有新冠疫苗研发价值，构建了P4三聚体表达载体3×P4，并进行蛋白表达及纯化（图3a和b）。Westernblot结果证实该三聚体蛋白能被单抗G5所识别，表明重组蛋白具有较好的免疫原性（图3c）。用P4三聚体蛋白免疫小鼠制得多抗血清进行假病*中和试验发现，该多抗能有效中和SARS-CoV-2S蛋白假病*，并呈剂量依赖性（图3d）。
图3P4三聚体蛋白有效诱导小鼠产生抗SARS-CoV-2中和抗体
随后为探究抗P4单抗抑制新冠病*入侵的机理，进行了S蛋白介导的细胞-细胞融合抑制试验。结果发现单抗G5能有效抑制SARS-CoV-2S蛋白介导的细胞-细胞间融合，且呈剂量依赖性，而单抗E2及对照抗体均不能抑制该细胞融合（图4a）。因此，针对P4的抗体可能通过阻断病*和宿主细胞膜的融合来抑制病*进入宿主细胞（图4b）。
图4抗P4抗体抑制SARS-CoV-2感染宿主细胞的机制探究
总之，该研究发现了一种源于SARS-CoV-2S2蛋白的新型广谱线性保护性多肽，与其他交叉中和表位不同，其在SARS-CoV、BatCoV-RaTG13、SARS-CoV-2和SARS-CoV-2变体中均高度保守。鉴于当前SARS-CoV-2变体及其免疫逃逸株的不断出现，诸如该研究中的P4广谱保护性多肽的鉴定及对应中和单抗G5等的研制，为开发通用新冠疫苗和治疗药物提供了契机。据悉，研究者目前正在检测G5单链抗体抗新冠病*效果以及大量表达P4三聚体蛋白，拟开展相关的动物体内试验研究。
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