一.绪论
1.基因的定义：基因是一段能产生功能性肽链或RNA的核苷酸序列,是遗传物质最小的功能单位。
2.基因表达的时间特异性：某一特定基因的表达严格按特定的时间顺序发生，这就是基因表达的时间特异性。
3.基因表达的空间特异性：在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现。
4.管家基因：某些基因产物对生命全过程都是必需的或必不可少的，这类基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达。
5.诱导与阻遏:
（1）在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可诱导的。可诱导基因在特定环境中表达增强的过程称为诱导。
（2）基因对环境信号应答时被抑制，这种基因是可阻遏的。可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏。
6.基因工程的定义：通过基因操作来定向改变或修饰生物体或人类自身，并具有明确应用目的的活动。
7.基因工程的基本过程：分、切、连、转、选、鉴
8.基因工程的应用：
（1）生产基因工程药品
（2）用于基因诊断与基因治疗
（3）器官移植
（4）培育高产优质或具有特殊用途的动植物新品种
（5）用于环境监测和净化
DNA二.基因工程工具酶
1.基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、修饰、反转录等有关的各种酶系统。
2.限制作用：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。
3.修饰作用：指寄主通过甲基化酶的作用，使DNA甲基化得以修饰，从而免遭限制酶的破坏。
4.限制性核酸内切酶（RE）：是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。
5.限制性内切酶的种类分为一型，二型，三型，二型，最常用。
6.二型限制性内切酶的特点：
（1）二型限制与修饰系统所占的比例最大
（2）二型限制酶一般是同源二聚体，由两个彼此相按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在DNA链的两个互补位点上。
（3）是单一亚基只具有识别切割作用，修饰作用有其他酶进行。
（4）识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA须Mg+的存在，才能发挥活性。
（5）识别靶标序列长4～7bp.切割位点距离识别位点20bp内
7.一型限制性内切酶（三亚基双功能酶）：
（1）种类很少，只占1%
（2）其限制酶和甲基化酶各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别DNA序列的s亚基
（3）同时具有修饰和识别切割的作用，辅助因子ATP，镁离子，s腺苷甲硫氨酸。
（4）切割位点在识别位点bp以外，且无特异性。
8.三型限制性内切酶（2亚基双功能酶）：
（1）种类很少，所占比例不到1%
（2）限制酶和甲基化酶各作为一个亚基存在于酶分子中，同时具有修饰及识别切割的作用，需辅助因子ATP，Mg+，s腺苷甲硫氨酸。
（3）切割位点在识别位点下游24～26bp处
9.限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列。
10.限制酶的酶切切口：黏性末端、平末端
11.黏性末端：被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。
12.平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整的。
13.同裂酶（同切点酶）：又称异源同工酶，指来源不同，但具有相同的识别序列，切割位点可以相同也可以不同。
14.同尾酶：能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同黏性末端的限制性内切酶。这两个相同的黏性末端称为配伍末端。
15.DNA末端长度对限制酶切割的影响：识别序列两端必须有一定数量的核苷酸
16.位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的某些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象。
17.星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
18.引起星星活性的因素：甘油浓度过高，酶过量，离子强度低，Ph过高，有机溶剂，其他阳离子代替了Mg+
19.酶切反应条件：
（1）缓冲液：提供稳定的ph值和缓冲剂，Mg+，DTT（二硫苏糖醇），BSA(小牛血清蛋白)
（2）反应温度大多为37℃
20.终止酶切的方法：EDTA，加热，苯酚抽取去除蛋白
21.RFLP：限制性片段长度多态性技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定的DNA片段的大小。
22.DNA聚合酶：又称DNA依赖的DNA聚合酶，它是以亲代DNA为模板，催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一类酶。
23.DNA聚合酶1：（1）5→3DNA聚合酶活性（2）5→3核酸外切酶活性（3）3→5核酸外切酶活性（校正作用）
24.Klenow片段：DNA聚合酶1用枯草芽孢杆菌蛋白酶处理后，该酶被降解成两个片段，较大的片段包括~残基，称为Klenow片段。具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性。
25.TaqDNA聚合酶：是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶，催化DNA合成的最适温度为70~75℃。具有5＇→3＇聚合酶活性和5＇→3＇外切酶活性但没有3＇→5＇外切酶活性，因而无3＇→5＇方向的校正功能。
26.T4DNA聚合酶：是一种携带有高表达噬菌体的大肠杆菌中提纯制备而来的。
具有5＇→3＇聚合酶活性和3＇→5＇外切酶活性（该活性比DNA聚合酶一强）
27.T7DNA聚合酶：从t7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，有两个亚基组成。T7噬菌体基因5编码的大亚基.大肠杆菌编码的小亚基，硫氧还蛋白，增加大亚其对模板的亲和性。
28.逆转录酶：是一种依赖RNA的DNA聚合酶，即以rna为模板合成DNA，合成方向为5＇→3＇延伸，无3＇→5＇外切酶活性。
29.逆转录酶具有以下3种活性：
（1）以单链rna为模板催化合成cDNA单链
（2）具有RNaseH活性，能水解RNA:DNA杂交链中的RNA
（3）以DNA为模板，催化合成cDNA双链
30.DNA连接酶:能催化合成双链DNA片段靠在一起的3＇羟基末端与5＇端磷酸基团末端之间通过形成磷酸二酯键，使两末端连接的一种核酸酶。
31.大肠杆菌DNA连接酶，依赖NAD＋供能
T4DNA连接酶依赖ATP供能（广泛使用）
32.碱性磷酸酶：用于脱去DNA5＇末端的磷酸根，使5＇—p成为5＇—oH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。
33.多聚核苷酸激酶：催化多聚核苷酸5＇羟基末端磷酸化，用于标记探针。
34.末端转移酶：将标记或未标记的dNTP加到3＇—OH末端，也可催化载体分子或待克隆的DNA片段上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。
35.S1核酸酶：只水解单链DNA或RNA，用于将黏性末端水解成平末端及cDNA发夹式结构的处理。
36.核糖核酸酶H：催化DNA:RNA杂合链中RNA部分的内切降解作用。
三.载体
1.基因载体是一类能自我复制的DNA分子，其中的一段DNA被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源（目的）DNA而将目的DNA代入宿主细胞。
2.理想的载体应具备的条件：
1)能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制止和启动子使插入基因复制和表达
2)具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个多源DNA片段插入其中。
3)具有容易检测的筛选标记
4)载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝
5)在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失
3.质粒：是独立于染色体外，具有自主复制能力的遗传单位，其本质是较少的核酸分子大小在1kb~kb以上不等。
4.质粒的生物学特性：
1)质粒的自主复制性
2)质粒的不相容性：是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象。
3)质粒的可转移性：在自然条件下，很多质粒可通过称为细菌接合的作用，转移到新的宿主细胞内
4)携带特殊的遗传标记
5.质粒载体的构建：
1)加入合适的选择标记基因，通常是抗生素基因
2)增加或减少合适的酶切位点，便于重组
3)缩短长度，切去不必要的片段，增加装载量
4)改变复制子，由严紧变为松弛型，以增加拷贝数
5)加装特殊的基因元件
6.插入失活：一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象。
7.α互补：质粒还有一个来自大肠杆菌的经过加工LacZ＇的基因，它编码β半乳糖苷酶氨基酸个氨基酸，可以和β半乳糖苷酶的缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补，恢复分解乳糖的能力。
8.蓝白筛选：X—gal是β半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当外源基因插入到PUC质粒的LacZ＇基因内部，则LacZ＇基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的β半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。（在培养基中加amp，X—gal.IPTG进一步筛选）
9.T载体：Taq聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片段的3＇末端添加一个核苷酸，通常为A，根据这一特点研制出线性T载体，其5＇各带有一个不配对的T，从而进行黏端互补连接，达到高效克隆的目的。
10.穿梭质粒载体：是由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。
11.科斯质粒载体（cosmid载体）：也称粘粒。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos末端及质粒载体重组而成的载体。
12.cos位点：λ噬菌体颗粒中的DNA为线状双链DNA分子，全长bp，两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端）
13.噬菌体载体的构建：
（1）去除非必须区，建立外源DNA片段的克隆或替换点
（2）在λ噬菌体的非必须区内插入选择标记基因：CI基因失活，Spi筛选，Lacz蓝白斑筛选
（3）建立重组的λDNA分子的体外包装系统
14.CI基因的表达促进λ噬菌体进入溶源状态，基因CI产物活性受到影响会促进λ噬菌体进入裂解循环。CI基因失活后导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。
15.Spi筛选：野生型λ噬菌体不能在P2噬菌体溶源性细胞内生长，这是受λ噬菌体red和gam产物控制的。因此，red和gam被外源DNA取代后，获得的spi—表型，能够在P2噬菌体溶源性细胞内生长。
16.M13噬菌体：闭合环状单链ssdna，可以直接转染宿主，但缺少选择标记和克隆位点
17.酵母人工染色体载体（YAC）：把酵母染色体与基因复制和表达有关的主要组件都组装质粒上，令质粒行使酵母的转录功能和复制功能。
18.表达载体：在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件，如启动子、核糖体结合位点、终止子等，使目的基因能够表达的载体。
19.表达载体必须具备的条件
1)载体能够独立的复制
2)具有灵活的克隆为位点和方便的筛选标记
3)具有很强的启动子
4)具有阻遏子
5)具有很强的终止子
6)有翻译的起始信号
20.外源基因在原核细胞中表达的表达元件：
1)启动子：是RNA聚合酶识别结合和开始转录的一段DNA序列
2)SD序列（核糖体结合位点）：它是由起始密码上AUG和一段位于AUG上游3~10bp处的3~9bp的序列组成。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16sRNA3＇末端的富含嘧啶的序列互补，mRNA于是与核糖体很好结合。
3)增强子
4)转录终止子
5)翻译起始密码子
6)翻译终止密码子
21.外源基因在原核细胞中的表达方式：
1)组成型表达：T7噬菌体启动子等属于组成型启动子，在该类启动子的驱动下，外源基因源源不断地表达，产量高，但不适合有*蛋白的表达
2)诱导型表达：Lac启动子，IPL启动子，等，可控制表达，适合大多蛋白，特别是有*蛋白的表达。
3)融合型表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（tag），表达为融合蛋白，可方便后续的蛋白分离纯化或检测。His—Tag最广泛。
4)分泌型表达：在起始密码和目的基因之间加入一个信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，可避免表达产物在细胞内过度积累，而影响细胞的生长。
22.酵母质粒表达载体：一般构件为穿梭载体，即可在大肠杆菌中，又可以在酵母细胞中进行复制和扩增。
23.Ti质粒：是在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色质之外，自主复制的环形双链DNA分子。
24.Ti质粒表达载体构建：一元载体和双元载体
25.一元载体：含目的基因的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体。
26.双元载体：是指两个分别含有T—DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统，其中之含有T—DNA转移所必须的Vir区段，它缺失或部分缺失T—DNA序列，其主要功能是表达*蛋白激活T—DNA转移，也称辅助Ti质粒。另一个则是含有T—DNA的微型质粒，它带有目的基因和大肠杆菌及农杆菌复制起始点。
27.病*表达载体：是以病*基因组序列为基础，插入必要的表达元件所构建成的真核基因转移工具。
28.病*表达载体的应用：
1)外源蛋白的真核表达：杆状病*表达载体、痘病*表达载体
2)基因治疗：反转录病*载体、腺病*表达载体
3)多价、多联活载体疫苗的研制：痘病*
4)基因功能鉴定：反转录病*载体
29.RNA干扰：双链RNA对基因表达的阻断作用，是真核生物中普遍存在的转录后基因沉默机制。
30.多克隆位点（MCS）：指DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限制性内切酶识别位点，能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。
四.基因操作中大分子的分离与分析
1.核酸凝胶电泳的基本原理：
核酸分子中磷酸基团一般呈离子化状态，DNA和RNA的多核苷酸链实际上是多聚阴离子，它们在电场中可向着正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA或rna分子的迁移速度取决于核酸分子大小和构型。
2.影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：
DNA分子大小、构象、凝胶浓度、电压、缓冲液
3.琼脂糖凝胶电泳：用于分离大于~bp的片段，操作简单，快速且分离范围广，分辨率高。
4.聚丙烯酰氨凝胶电泳：适用于小分子DNA（5~bp）的片段，寡聚核苷酸和蛋白质的分离，可分离相差一个核苷酸的不同DNA片段，是DNA序列分析的关键技术之一。
5.脉冲电场凝胶电泳：这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。主要用于大于40kb的DNA和染色体的分离。
6.分子杂交：是标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。
7.探针：一段带有检测标记的与目的基因或目的DNA特异互补的已知核苷酸序列。
8.探针的标记方法：缺口平移法、随机引物标记法、末端标记法
9.Southernblot：DNA—DNA杂交
10.Northern杂交：DNA与RNA，应用特异性基因探针分析基因的转录水平
11.WesternBlot：是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。
五.PCR技术（聚合酶链式反应）
1.PCR的原理：
类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性退火延伸三个基本步骤构成，在taqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，新链又可成为下次循环的模板，重复循环变性退火延伸三个过程，就能把目的基因扩增放大。
2.PCR的反应体系：
1)4种dNTP混合物：各umol╱l
2)引物：各10~pmol
3)模板DNA：0.1~0.2ug
4)TaqDNA聚合酶：2.5ug
5)Mg+：1.5mmol╱l
3.引物设计要求：
1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列
2)引物长度以15~40bp为宜
3)碱基尽可能随机分布，G+C占50~60%
4)引物内部避免形成二级结构
5)引物间避免有互补序列
6)引物3＇端为关键碱基，5＇端无严格限制
4.PCR的基本过程：
1)变性：使双链DNA解链为单链，95℃，20~30秒
2)退火：37~72℃，使引物与模板的互补区结合。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合，降低温度可增加反应的灵敏性
3)延伸：70~75℃，延伸时间由扩增片段长度决定
5.PCR循环次数主要取决于模板DNA浓度一般为25到35次。
6.不对称PCR：两条引物比例相差较大的PCR，可用于扩增产生特异长度的单链DNA
7.反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
8.多重PCR：它是在同一反应体系中，用多对引物同时扩增几种基因片段的方法，主要用于同一病原体分型及同时检测多种病原体。
9.LP—PCR：利用同位素，荧光素等对pcr引物进行标记，用以直观的检测目的。
10.锚式PCR：是在基因未知序列端添加同聚物尾，再用根据同聚物尾设计引物和已知序列的特异性引物进行pcr扩增，获得的PCR产物中包含了未知序列。
11.RT—PCR：先在反转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA一条链，再以cDNA第一链为模板，加入dNTP和两个特异性引物进行pcr，扩增出特异mRNA相应的cDNA。
12.原位PCR：是指直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行pcr扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测目标序列的细胞的一种方法。
13.链终止法测序：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链，由于合成的互补链可在不同位置随机终止，反应产生只差一个核苷酸的DNA分子，从而来读取待测DNA分子的顺序。
六.克隆
1.DNA克隆：为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中扩增，得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆。
2.DNA克隆技术可归纳为：分、切、接、转、筛
3.目的基因的获取方法：
1)化学合成法（要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列）
2)基因组DNA文库
3)cDNA文库
4)PCR
4.基因组DNA文库：存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。
5.cDNA的定义：是指互补DNA，特异指在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链
6.cDNA文库：是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA片段，与某种载体连接而形成的克隆的集合。
7.外源基因与载体的连接：
1)粘性末端连接：同一限制酶切位点连接，不同限制酶切位点连接
2)平端连接：平末端的直接连接、同聚物加尾连接（在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，再连接）、人工接头连接（人工接头是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段，由平端加上人工接头，在用限制酶酶切产生黏性末端，再进行粘端连接）、DNA衔接物连接法（也是人工合成的一段双链寡核苷酸链，与人工接头不同的是一头为平末端，另一头带有某种限制内切酶的粘性末端）
8.重组DNA导入受体菌的方法：
1)Cacl2法：细菌在低温和低渗环境，通透性增加，膨胀成球形，吃时转化混合物中的DNA形成羟基钙磷酸混合物黏附于细胞表面，经短暂热休克，促进细胞吸收重组子
2)电穿孔法
3)转染试剂法：阳离子型脂质体
4)显微注射法
5)基因枪
9.感受态：受体细胞经过一些理化或生物学方法处理后，能够从周围环境中摄取DNA分子，这种特殊生理状态
10.转化（基因工程概念）：是指以质粒为载体，将外源DNA导入处于感受态的大肠杆菌等原核宿主细胞，并使其获得新的变型的过程。
11.转导：由噬菌体和病*载体的DNA重组分子包装成病*颗粒，通过感染的方式将遗传信息传递给另一细胞的过程。
12.转染：是真核细胞在一定条件下主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。
13.转化率（cfu╱ugDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。
14.重组体的筛选与鉴定：
重组子：是指含有重组DNA分子的转化细胞
（1）载体表型选择
（2）插入基因选择法：DNA水平鉴定（特异pcr，以外源基因两侧序列设计引物，酶切鉴定）、转录水平鉴定、翻译水平鉴定
七.表达
1.基因表达：是指外源基因克隆到某种表达系统的载体中，再引入合适的宿主细胞中合成功能性基因产物的过程。
2.包涵体：重组蛋白在胞内表达时，常常以不溶性蛋白聚集成的晶状物形式存在，这种晶状体即包涵体。
八.补充：
1.限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响
⑴酶的纯度
⑵DNA样品的纯度.
⑶DNA的甲基化程度.
⑷酶切反应的温度与时间
⑸DNA分子的构型.
⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液.
2.大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点？真核基因在大肠杆菌中表达存在哪些障碍？
（1）特点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。
（2）存在的障碍：
第一，在大肠杆菌的mRNA的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及16S核糖体RNA3′末端碱基互补序列，即S-D序列，而真核上缺泛这个序列。
第二，许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。
第三、外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。
3.如何有效地提高外源基因的表达效率？
⑴提高启动子强度
⑵缩短启动子同克隆基因间距离
⑶高效的翻译起始序列
⑷高效的转录终止区
⑸提高质粒拷贝数及稳定性
⑹用以下方法提高翻译水平：
①调整SD序列与AUG间的距离
②用点突变的方法改变某些碱基
③增加mRNA的稳定性的
⑺减轻细胞的代谢负荷：
①诱导表达
②表达载体的诱导复制
⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：
①克隆一段原核序列，表达融合蛋白
②采用某种突变菌株
③表达分泌蛋白质
4.PCR技术主要应用在哪些领域？
①核酸基础研究
②序列分析
③检测基因表达
④从cDNA文库中放大特定序列
⑤研究已知片段邻近基因或未知DNA片段
⑥进化分析
⑦医学应用
⑧分析生物学证据
⑨性别控制
⑩转基因检测