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星耀小课堂mRNA篇mRNA序列设计 [复制链接]

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注:本文不构成任何投资意见和建议,以官方/公司公告为准;本文仅作医疗健康相关药物介绍,非治疗方案推荐(若涉及),不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。

#mRNA#

前言

mRNA序列设计和递送系统是mRNA整个制药领域最核心最关键的两个方面,也是跟mRNA成药性密不可分的。mRNA稳定性、翻译效率以及内在免疫原性是mRNA成药性的关键。序列设计至关重要,它影响mRNA体外转录的产量、mRNA分子的免疫原性、翻译效率和mRNA分子的稳定性。

mRNA序列设计的目的主要是提高蛋白表达强度、增加蛋白存留时间、减少使用剂量,降低药物成本。目前mRNA是由5cap(帽结构)、5UTR(非编码区域)、ORF(编码蛋白的开放阅读框)、3UTR和3polyA尾(多聚腺苷酸尾)这5个元件构成的(图1)。mRNA序列设计主要包括5UTR,ORF,3UTR。下面菌菌就从这几方面入手,讲讲怎么设计出高性能的mRNA序列。

图1mRNA的结构组成及优化策略

mRNA序列设计:5Cap

5Cap保护mRNA不被外切酶降解,与3端的polyA尾、polyA结合蛋白(PAPB)和翻译起始因子蛋白协同作用,起始蛋白质的翻译。体外转录(InVitroTranscription,IVT)的加帽是常用的加帽方式,可以在IVT时加帽(即共转录加帽),也可以在IVT结束后加帽(即酶法加帽)。

但是应当注意mRNA可以被反向加帽,从而导致快速地降解和较低的翻译效率。为了避免反向加帽,抗反向盖帽类似物(anti-reversecapanalogs,ARCA)被开发和使用,从而确保加帽的正确性。过去的几年时间,更多的核苷酸修饰致力于使用ARCA,如新开发的CleanCap类似物。所以,稳定的、正确方向的帽子结构应当被考虑到高效的mRNA疫苗中。

mRNA序列设计:5UTR

5UTR可被核糖体识别,调控mRNA的翻译,影响mRNA的稳定性。在mRNA疫苗/药物的研发过程中,有4种优化5UTR序列的策略:

1.直接选取在人体细胞内表达效率极高的基因的5UTR,例如人类α-球蛋白基因的5UTR。在活细胞中,α比β-球蛋白5UTR拥有更高的翻译效率(图2),这与年Kozak在体外系统得到的结果是相反的。

2.通过病原体mRNA自身的天然5UTR。

3.通过对数富集的方式来实现5UTR的系统演化,这种方法最早用于3UTR的筛选。

4.通过深度计算模型从海星的数据库中进行高通量筛选。

图2α、β-球蛋白5UTR的翻译效率

最短5UTR序列设计

在年,CarstenRudolph等人发表文章MaximizingthetranslationalyieldofmRNAtherapeuticsbyminimizing5-UTRs,报告了七种简约5UTR序列在细胞培养和体内转染后对编码荧光素酶的未修饰和不同化学修饰mRNA的翻译的影响[1](表1)。由14个核苷酸组成简约5UTR,将T7启动子与Kozak共有序列相结合,在HepG2和A细胞中产生与含有37个核苷酸的人类α球蛋白5-UTR相似甚至更高的表达。

表17种合成简约的5-UTR序列

T7启动子序列(TAATACGACTCTATA),T7启动子序列可以分为两个结构域:从﹣17到﹣5的上游结合结构域;从﹣4到﹢6的转录起始结构域。对于转录起始结构域来说,任何碱基的替换都会严重影响到启动子的强度,因此在设计UTR序列时采用原始的GGGAGA序列最佳。在UTR1的设计中,直接将T7转录起始位点与Kozak序列连在一起,UTR2引入一个碱基,UTR3-6引入2个碱基。在真核细胞中大概有5%的编码蛋白的基因存在一种非常独特的保守的短5UTR,称为TISU序列。以UTR3序列作为模板,用TISU序列替换Kozak序列产生UTR7序列。

图3A和HepG2细胞的蛋白质裂解物中的荧光素酶活性及其在小鼠体内表达

来自肝脏和脾脏的萤光素酶测量体外数据表明,简约的UTR3序列和UTR7序列与人类α球蛋白的5UTR一样有效或更好(图3)。这些发现通过编码人类促红细胞生成素(humanerythropoietin,hEPO)的mRNA得到证实。之前的研究报道,确保翻译起始的mRNA5端序列最短长度是32nt。如果少于32nt,翻译将会在起始密码子下游的ATG起始。与此相反的是,此研究合成的5UTR序列少于15nt,在细胞和体内均具有非常不错的表达效率,证明了合成简约的5UTR在转录疗法中具有巨大的潜力。

mRNA序列设计:ORF

作为mRNA的编码区,开放阅读框(ORF)的可翻译率无疑是至关重要的。因此,在该区域选择合适的密码子可以优化mRNA的整体翻译效率。目前已经进行了几种方法来修改ORF序列以提高翻译效率,并阻止由于模式识别受体(patternrecognitionreceptor,PRR)识别而产生的强先天免疫反应。ORF可以在密码子水平(密码子使用偏差)进行修改以调节翻译延伸率,或通过GC含量来避免二级结构。

密码子优化可以增强mRNA翻译和稳定性,密码子优化最基本的原则就是用宿主细胞中使用频率高的同义密码子去替换外源mRNA序列中的密码子,保证外源mRNA序列中的密码子和宿主细胞的密码子使用偏向性更加契合,避免出现稀有密码子。但是,我们需要知道,密码子并不是影响蛋白表达的唯一因素,还存在其他因素,例如稀有密码子,GC含量,二级结构(自由能)等。

当把外源mRNA序列中的密码子全部更换为宿主细胞的最佳密码子,可能反而导致蛋白无法表达,因为由一些蛋白的表达(例如复杂的抗原)需要稀有密码子的存在,延缓核糖体前进的速度,为蛋白质的正确折叠来提供足够的时间。因此,可以根据不同的抗原使用不同的密码子优化策略。

此外,增加GC含量已被证实可以增加mRNA的稳定水平,和提高体内的蛋白表达量。同时这一方案也被CureVac最新的疫苗临床试验中使用。在年,GrzegorzKudla等人[2]发现在哺乳动物细胞中,富含GC的基因表达效率要比低GC含量的基因高出几倍到一百倍,这种现象是由于富含GC的基因更加高效的mRNA转录或者加工,产生更多的处于稳定状态的mRNA。最后,还有mRNA序列的二级结构也应当被考量。有趣的是二级结构的发夹结构,可以影响mRNA的降解。最近有新的计算方法被报道,mRNA序列和最大的碱基堆积有助于mRNA的稳定性。

mRNA序列设计:3UTR

3UTR主要调控mRNA的翻译和稳定性。高表达基因的天然UTR是合成mRNA的首选,如α和β-球蛋白基因来源。除了使用稳定的mRNA序列外,还可以通过两次串联添加3UTR序列来改善蛋白质表达[3,4]。

最近开发的一种方法[3]用于识别稳定mRNA的3UTR序列,该方法通过逆转录酶的几个循环:转染到人类树突细胞(dendriticcells,DC)、转录抑制和mRNA纯化,逐步富集较长半衰期的合成mRNA。该方法还确定了DC中miRNA结合位点的数量与mRNA半衰期之间呈负相关。因此,可以检查UTR序列以尽量减少抗原呈递细胞(antigen-presentingcells,APC)中miRNA结合位点的数量,因为这些分子会促进mRNA降解。也可以在mRNA序列中加入miRNA结合位点,以降低非靶向组织中的抗原表达。

mRNA序列设计:polyA尾

PolyA尾与polyA尾结合蛋白(PAPB)结合,PAPB跟翻译起始因子eIF4G相互作用,使得mRNA形成“闭环”结构,有助于募集40S翻译起始复合物到mRNA上,与5末端帽子结构协同作用,共同刺激翻译起始。在细菌扩增过程中,携带长的聚均核苷酸序列的质粒会产生不可预测的重组事件,质粒上的polyA尾巴随着细菌的不断扩增发生缩短,这会对携带过长polyA尾巴质粒的克隆和扩增造成麻烦,因此研究人员展开对携带polyA尾巴的质粒进行一系列的改进,希望可以找到避免polyA尾巴缩短的方法。

年,ZeljkaTrepotec等人发表文章Segmentedpoly(A)tailssignificantlyreducere

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