天津市白癜风医院 http://news.39.net/bjzkhbzy/210920/9468770.html前言
癌症是全世界最致命的疾病之一。近年来，免疫疗法被认为是一种非常有前景的癌症治疗策略，重点是重新激活癌细胞诱导的免疫抑制环境，提高抗肿瘤免疫反应。然而，免疫疗法仍然面临许多挑战。即使是最流行的抗PD-1/PD-L1和抗CTLA4疗法，也只有一小部分人表现出持久反应，这表明需要对癌症免疫进行更深入的研究。
年05月，国家肝癌中心、第二*医医院研究团队在AdvancedScience期刊发表的题为“TrajectoryandFunctionalAnalysisofPD-1CD4CD8TCellsinHepatocellularCarcinomabySingle-CellCytometryandTranscriptomeSequencing”的研究成果，采用质谱流式细胞仪、单细胞测序等研究方法，发现CD4/CD8双阳性T(DPT)细胞的存在，并表征了DPT细胞的分子特征，DPT细胞在HCC中的独特分布和临床预后的相关性，为肿瘤相关DPT细胞的功能和起源提出了新的见解。
研究背景
肿瘤免疫微环境的空间异质性是肿瘤免疫治疗的主要挑战，HCC微环境显示出比非肿瘤组织更复杂和免疫抑制的表型，可诱导肿瘤逃逸并促进疾病进展。本研究通过使用单细胞规模的飞行时间质谱（CyTOF），发现免疫细胞组成空间变化。通过对T细胞群的深入分析，作者确定了一小部分共表达CD4/CD8双阳性T细胞(DPT)。单细胞RNA-seq和TCR-seq进一步表征了DPT细胞的分子特征和克隆型。结果表明，肿瘤相关的DPT细胞可能来源于浸润的CD4或CD8单阳性T(SPT)细胞。
研究思路
研究结果
1.肝细胞癌主要免疫谱系的空间异质性
作者首先对来自肿瘤核心（T）、非肿瘤区域（N）和前沿区域（L）的39个匹配组织标本进行了大规模的大规模细胞免疫分析（图1A），免疫谱系的分布在tSNE图中可视化（图1B）。观察到HCC中T细胞的数量从N区逐渐减少到T区，而B细胞的趋势相反；观察到几个T细胞亚簇在L区域显著富集（图1B），在来自不同区域的不同免疫细胞谱系中观察到表面标志物的多样化表达模式（图1C，D）。这些结果表明，HCC中的免疫微环境在空间上是异质的。
图1
肝细胞癌主要免疫细胞谱系的空间异质性
整个工作流程的图形摘要。提取手术切除的样本中的免疫细胞并用金属标记的抗体进行处理，然后进入飞行时间质谱流式细胞仪管道。获得的数据在降维后可视化。通过手动门控策略和聚类算法识别细胞簇。T指肿瘤核心区；L指前沿区域；N指非肿瘤区域。
2.T细胞簇呈现区域多样性并在L区域显示出独特的特征
为了探索三个区域中不同的T细胞亚群组成，作者可视化并重新分析了T细胞亚群。通过应用FlowSOM算法，可以将T细胞划分为40个簇（包括来自三个区域的所有T细胞）（图2A）。然后，作者首先将40个集群分类为经典的T亚型。发现CD4效应记忆T细胞(Tem)从N到L到T区域逐渐增加，而CD8Tem则呈现相反的趋势（图2B）。图表根据面标记的代表性表达模式（图2D，E），发现几个富含T的T细胞簇（8,7,3,2,1）表现出衰竭状态，PD-1水平高，HLA-DR表达低，许多富含N的簇(39,33,32)表现出PD-1/HLA-DR低表达和CD45RA表达增加的静止状态。
作者注意到，在13名HCC患者中，至少有8名（61%）的L区富含DPT细胞。此外，作者还观察到DPT簇与簇21、16、26、12、15和11之间的强表型相关性，它们都是CD28T细胞。
图2
T细胞簇的构成表现出区域多样性，L区在T细胞方面表现出独特的免疫背景
3.肿瘤相关DPT细胞的表型和功能
为在T细胞成熟过程中，经典的DPT细胞是胸腺中定义明确的幼稚T细胞。然而，对肿瘤相关DPT细胞的分子特征和功能的研究很少。为了进一步探索DPT细胞的潜在贡献，作者根据CD4和CD8的表达模式将T细胞分离为CD4单阳性(CD4SPT)、CD8单阳性(CD8SPT)、双阴性(DNT)和双阳性(DPT)细胞(图3A)。如图3B所示，在高达70%的HCC患者(9/13)中发现L区DPT细胞显著增加。作者进一步探讨了DPT细胞中T细胞活化标志物和T细胞耗竭标志物之间的共表达模式。在PD-1、CXCR3、CCR4和CD28之间观察到强阳性共表达（图3D）。此外，发现记忆T细胞的标志物CD45RO与PD-1呈阳性共表达。流式细胞仪手动门控图进一步证实了这种共表达。
观察到包括CD28、CD69、CD44和ICOS在内的T细胞活化相关标志物在PD-1CD45RODPT细胞中上调，表明PD-1CD45RODPT细胞可能表现出活化表型。这种在SPT细胞中表达和激活的PD-1表型已在肺癌中报道。
然后，通过比较SPT、DPT和DNT细胞之间免疫耗竭因子的表达水平。几乎所有免疫衰竭标志物在PD-1CD45RODPT细胞中均显著上调（图3E、F）。通过体外实验，作者发现在PMA和离子霉素刺激后，DPT细胞（从L区分离）表达更高水平的IFNγ、TNFα，这证实了DPT细胞可能处于激活阶段（图3G）。DPT表达的IL-2水平与CD8SPT细胞相似，这表明它们具有激活其他T细胞的能力。
图3
DPT细胞的表型和功能
4.DPT细胞存在于各种具有相似表型的人类癌症中，是HCC的重要预后因素
为了进一步确认PD-1DPT细胞在体内的空间分布，作者同时用CD4/CD8/PD-1抗体标记HCC组织，并检查T细胞在T、L和N区域的散发性浸润（图4A）。与之前的结果一致（图2C），CD8SPT细胞主要位于N区，CD4+SPT细胞主要位于T区。PD-1DPT细胞在T/N区几乎看不到，在L区广泛存在，所有三种抗体的染色信号都很强。通过HALO软件计数PD-1DPT（三阳性）细胞数。作者发现PD-1DPT细胞在不同HCC患者的L区是可变的（图4B），并且与DPT细胞的数量高度相关（图4C）。
生存分析表明，更多的DPT细胞和PD-1DPT细胞显著表明更好的总体生存率和无复发生存率（图4D）。但是，对于T或N区域，无法观察到该结果，提示DPT细胞可能在L区特异性发挥其功能。
为了进一步验证DPT细胞的存在和功能，分析了另外30例独立HCC病例和10例肝内胆管癌(ICC)病例以及之前报道的70例肾透明细胞癌(RCC)病例的T细胞谱。如以上部分所述，与SPT细胞相比，在所有三个数据集中都发现了具有更高免疫检查点标记表达的DPT细胞（图4E）。为了扩展作者的发现，作者用Hepa1-6细胞系验证了两种HCC小鼠模型（原位/皮下）中DPT细胞的存在（图4F，G）。此外，PD-1表达在鼠DPT中明显上调。总之，这些结果表明DPT细胞不仅存在于HCC中，还存在于其他肿瘤中。
图4
DPT细胞存在于具有相似表型的各种人类癌症中，并在HCC中显示出预后价值
5.B单细胞RNA-Seq和TCR-Seq对肿瘤相关DPT细胞的表征
CyTOF抗体panel的检测范围受限于可用金属同位素的数量，为了进一步探索DPT细胞的功能和进化轨迹，作者对个肿瘤相关DPT细胞(TDPT)、个CD4单阳性T细胞(TCD4T)、个CD8单细胞进行了分类和执行单细胞RNA-seq和TCR-seq阳性T细胞(TCD8T)和个PBMCCD3T细胞（图5A），scRNA-seq分析确定了11个DPT细胞亚群（图5B，C）。
为了检查不同DPT簇的表型，作者分别根据与FGFBP2、IFNG和HAVCR2表达相关的前20个基因，通过细胞*性、激活和耗竭特征对细胞进行评分。TDPT_3_CTLA4和TDPT_6_FOXP3都具有高耗竭特征，伴随着低细胞*性和激活特征（图5D）。然后，作者检查了所有DPT簇中的细胞*性和耗竭特征之间的联系，并观察到大多数DPT簇表现出高细胞*性特征或耗竭特征（图5E）。总的来说，TDPT_10_LAG3在表型上与之前CyTOF分析定义的PD-1DPT细胞一致。
通过分析DPT集群中的TCR克隆型，作者发现TDPT_2_CCR7、TDPT_3_CTLA4和TDPT_6_FOXP3具有最多的不同TCR克隆型，且扩展趋势最小（图5F）。相反，TDPT_1_FGFBP2、TDPT_5_KLRG1、TDPT_8_CD70和TDPT_11_KLRD1具有最少的TCR克隆型，但具有最高的扩展趋势，观察到DPT细胞的细胞*性和活化与TCR扩增呈正相关，而未分化和耗竭呈负相关(图5F）。
图5
通过单细胞RNA-seq和TCR-seq表征肿瘤相关DPT细胞
6.源自浸润性SPT细胞的肿瘤相关DPT细胞
虽然血液和外周淋巴组织中的DPT细胞已被广泛研究，但它们在癌症中的分子特征和细胞功能尚不清楚。CD45RO和PD-1的共表达在DPT细胞中最高，其他免疫衰竭标志物（TIM3和CTLA-4）在DPT细胞中的表达也略有增加。
对单个阳性T(SPT)细胞进行了scRNA-seq分析，包括个肿瘤相关CD4T细胞和个CD8+T细胞。CD4T细胞和CD8T细胞分别分为五个和六个簇（图6A、B）。作者分析了DPT细胞簇和SPT细胞簇之间的转录组相似性（特征基因表达的Pearson相关性）（图6C)。
TCR分析显示，与PBMC相比，TDPT细胞与TCD4和TCD8共享更多的TCR克隆，表明肿瘤相关DPT细胞最有可能从肿瘤内SPT细胞转化（图6D）。进一步发现DPT细胞主要与CD8T细胞共享高频TCR克隆（图6E）。在DPT/SPT的UMAP上预测了频率最高的前六个TCR克隆（图6F）。
通过应用多重免疫荧光组织染色，作者还观察到PD-1CD8SPT细胞在空间上比PD-1+CD4+SPT细胞更接近PD-1+DPT细胞，而在PD-1中没有发现这种差异-DPT细胞（图6G，H）。总之，作者的数据描绘了T细胞的表型发育路径，并表明PD-1DPT细胞来源于肿瘤内CD8T细胞，而不是胸腺中的PD-1CD4或幼稚T细胞。
图6
肿瘤相关的DPT细胞来源于浸润的SPT细胞
相关讨论
免疫微环境在不同癌症之间表现出高度异质性，在不同个体之间表现出高度多样性。对人类肿瘤中不同免疫成分的密度、位置和功能的探索导致了关键原癌和抗肿瘤免疫特征的鉴定。各种肿瘤的组织病理学分析证实，浸润的免疫细胞在肿瘤及其周围非肿瘤区域内的分布存在很大差异。肿瘤细胞和相邻基质细胞之间的串扰已被确定为肿瘤进展的重要驱动因素。基质诱导的炎症和血管生成已被证明具有促进肿瘤的作用。
然而，前沿区域（从肿瘤核心到相邻非肿瘤组织的过渡区域）的特征性免疫微环境尚未得到很好的研究。作者获得了个免疫细胞的表面标志物谱，并发现了不同的L区特异性免疫细胞特征。在T细胞方面，CD4和CD8双阳性T(DPT)细胞表达衰竭和激活标志物，在一些患者的L区显著富集。
以前，双阳性T细胞被描述为胸腺内的过早发育阶段。一般认为，一旦分化，CD4谱系和CD8谱系是针对单个细胞确定的。尽管已经报道了在某些疾病条件下成熟的DPT细胞，但对其起源和潜在的生物学功能知之甚少。
在作者的研究中，作者首先报道了大多数富含L的DPT簇具有表型活性和记忆样，具有增强的PD-1/CD45RO表达。在体外研究中，DPT细胞在刺激后表现出与SPT细胞一样的强烈免疫反应，证实了它们的抗肿瘤活性状态。作者发现L区富集的DPT细胞与HCC患者的更好结果呈正相关。总的来说，作者这里的数据暗示DPT细胞对HCC患者的潜在抗肿瘤活性。
为了进一步研究富含L的DPT细胞的多样性，单细胞测序并发现了11个DPT簇。基于独特的基因特征，表型与CyTOF定义的PD-1DPT细胞具有高度相似性，这证明了作者的假设，即PD-1DPT细胞是功能性活化细胞。
为了确定富含L的DPT细胞在T细胞发育轨迹中的位置，TCR-seq数据表明PD-1DPT细胞与PD-1CD8T细胞共享大多数TCR克隆型，表明具有相同的祖先，并且起源于肿瘤内CD8SPT细胞，这与之前的研究一致，即CD8T细胞在某些条件下可以转化为成熟的功能性DPT细胞。
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通过特定区域取样，结合CyTOF和单细胞测序技术，作者在HCC的L区定义了一个独特的富含DPT的免疫微环境。通过生信技术分析，作者鉴定出具有不同功能的多样化DPT簇。PD-1DPT细胞表现出激活状态，强烈表达衰竭和激活标志物，结合临床分析，提示其在HCC患者中具有潜在的预后价值。
此外在探索细胞起源上，作者通过单细胞测序和TCR测序技术手段，确定了PD-1DPT细胞的起源与PD-1CD8SPT细胞具有相同的祖先，并且很可能是从瘤内SPT细胞转化而来的，值得借鉴学习。
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