经常提质粒吗?
熟练之后,提质粒乃至质粒构建都很简单。
但如果真问起一些质粒的细节,可能很多人回答不了。
不信随我看看。
质粒基本组成要素
复制起始位点Ori即控制复制起始的位点
抗生素抗性基因——如常见的Amp+、Kan+,可便于加以检测或者筛选
多克隆位点MCS——用于克隆携带外源基因片段
P/E——启动子/增强子
Terms——终止信号
poly(A)信号——可起到稳定mRNA作用
如何阅读质粒图谱
第一步:首先看Ori的类型,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)
第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记
Ampr水解β-内酰胺环,解除氨苄的*性;
tetr可以阻止四环素进入细胞;
camr生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去*性;
neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶使G(卡那霉素衍生物)失活;
hygr使潮霉素β失活。
第三步:看多克隆位点(MCS)
它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。(如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活。)
第四步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。
不同的启动子适用于不同的宿主,选择载体主要依据启动子类型判断是否适用于目的工具宿主。
如何选择载体
选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要在指定宿主中表达一个特定的基因,则要选择与宿主相匹配的表达载体。如要做基因的原核表达,则需要选择原核表达载体。
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