资深冠状病毒专家建立遗传系统,探究新冠病 [复制链接]

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雅各布

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雪月

年5月27日，来自北卡罗来纳大学（UNC）教堂山校区的流行病学系、微生物与免疫学系教授、资深冠状病*专家RalphBaric课题组在Cell上提前在线发表了一篇题为“SARS-CoV-2ReverseGeneticsRevealsaVariableInfectionGradientintheRespiratoryTract”的文章，该研究建立了一个SARS-CoV-2的反向遗传系统，并利用该系统探究病*的呼吸道组织嗜性、致病机理与中和抗体检测。

病*学中的反向遗传系统，通常是指通过克隆病*的全长基因组cDNA至载体上并在细胞中复制出经过修饰过的子代病*，从而达到能改造病*遗传特性的目的。冠状病*的是RNA病*中拥有最长基因组的一个病*家族（2.8-3.5kb），其反向遗传系统的构建的困难较高，一直是制约该类病*基础研究的一个瓶颈。Baric课题组作为建立冠状病*反向技术的鼻祖，在年即通过一种分段克隆的方法，成功构建出了第一个冠状病*（猪传染性胃肠炎病*）的全长感染性cDNA克隆。在其后的三十年中，该课题组利用这项技术成功构建了30多种人类、动物冠状病*的感染性cDNA克隆，其中包括SARS-CoV与MERS-CoV，为冠状病*领域研究的发展贡献了极其重要的技术支持。

在本篇Cell文章中，Baric课题组利用了该技术，构建了一个SARS-CoV-2的感染性克隆。利用该系统，本文通过替换新冠病*的ORF7a为GFP或nLuc基因，成果制备出两个稳定表达报告基因的重组病*。文章发现，反向遗传制备出的重组病*与野生型病*在细胞系中的复制水平一致，并验证了蛋白酶TMPRSS2与Furin对新冠病*的复制有增强作用。利用了这两种重组病*，分别建立了新冠病*中和抗体的检测方法和新冠病*在人呼吸道的细胞嗜性。

目前，全球关于新冠病*的疫苗、抗体研究正如火如荼地进行，但中和抗体的检测严重受到技术的制约。利用假病*（pseudovirus）系统表达新冠病*S蛋白，虽然能实现荧光素酶（luciferase）高通量检测的需求，但假病*颗粒表面的S蛋白构相、密度都无法与新冠病*一致，导致中和抗体的检测结果可能与实际有偏差。利用活病*噬斑减少法（plaquereductionassay）来检测中和抗体，虽然保留了新冠病*原有的抗原性，但无法实现高通量检测。Baric课题组构建了表达纳米荧光素酶（nano-luciferase,nLuc）的重组新冠病*正好结合了上述两种方法的优点，实现了高通量、准确检测中和抗体。该文章同时利用了表达nLuc基因的重组SARS-CoV与MERS-CoV，检测了多种单克隆抗体及人类血清的交叉中和反应。

该研究发现，部分年SARS病人的血清能有限程度地中和新冠病*/SARS-CoV-2，但研究中10个COVID-19病人血清却无法中和SARS-CoV-nLuc病*，说明了两种beta-CoV存在保守的抗原表位，但交叉中和SARS-CoV的抗体的产生，在新冠病*感染的人群中可能是低概率事件。

利用纳米荧光素酶重组新冠病*检测人类血清的交叉中和反应

接下来该文章利用GFP重组新冠病*感染采自不同呼吸道区域的人原代细胞，COVID-19尸检组织样品染色等方法，鉴定出新冠病*在人类呼吸道从鼻腔至肺泡上皮细胞中的感染能力呈递减趋势。

尸检肺中通过RNA-ISH鉴定的SARS-CoV-2RNA从气管到肺泡的区域分布

该文章首先确定了鼻腔上皮细胞的ACE2表达水平，显著高于比喉炎、气管、支气管、末端支气管、肺泡上皮的水平。并且确定了鼻腔中纤毛细胞（ciliatedcells）的ACE2表达量比粘蛋白MUC5分泌细胞中要高。在exvivo的感染实验中，该论文利用表达GFP的重组新冠病*感染了采自鼻腔、支气管、末端支气管及肺泡的上皮细胞，并发现病*复制的趋势呈显著递减的趋势。并且在组织染色中，GFP信号与纤毛细胞的α-tubulin信号大量重叠，并且几乎不与黏蛋白分泌细胞的MUC5B、MUC5AC染色重叠。该文章还发现，1）新冠病*的GFP信号在不同个体采集的支气管上皮细胞中的分布呈现出个体差异性；2）表达GFP的重组病*（缺失了ORF7a蛋白）在人原代气管上皮细胞中的复制比野生型病*要弱，说明该病*蛋白对病**力有影响；3）SARS-CoV与新冠病*在采自同一个个体的气管上皮细胞中的复制水平基本一致。

通过RNAISH实验尸检气管中的SARS-CoV-2

在COVID-19病人尸检样品中，通过RNA原位杂交、免疫荧光染色等方法，同样观察到了新冠病*感染到细胞，在气管上皮主要为纤毛细胞，在肺泡主要为2型肺泡细胞。这些结果验证了exvivo染色等准确性。

本文总结模式图

该文章综合性地报道了新冠病*反向遗传系统、呼吸道组织嗜性、中和抗原性等方面的发现。该研究中所制备等工具，为新冠病*等基础及转化医学研究提供了重要的技术支持。