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为了迅速应对COVID-19病*威胁，相比传统病*研究中样本来源，获取病*必须来源于临床样本，如果能够更快速利用合成基因组构建SARS-CoV-2病*，以及能够应对更多新型RNA病*的体外合成需求，将使该构建系统具有更大的吸引力。
《Nature》杂志5月4日在线发表了这篇题为RapidreconstructionofSARS-CoV-2usingasyntheticgenomicsplatform的论文，该项研究由瑞士伯尔尼病*-免疫研究所和伯尔尼大学传染病-病理学系的JoergJores教授和VolkerThiel教授团队共同完成。该研究缘由对于如冠状病*等大的RNA病*基因组合成，由于大小和偶尔的不稳定性等因素影响，在大肠杆菌中克隆和操作起来很麻烦。而反向遗传学的蓬勃发展已经成为一种不可或缺的工具，彻底改变了对病*侵染机制和疫苗开发的认识。
图1-a，酵母内基因组重建需要一步提供重叠的DNA片段覆盖病*基因组和载体到酵母。病*开放阅读框(ORFs)表示绿色荧光蛋白(GFP)的ORF。改变DNA片段在酵母中通过同源重组组装，生成携带全长病*cDNA的YAC。感染冠状病*RNA的分离首先从YAC开始，其次是YAC.通过质粒线性化为T7RNA提供DNA模板polymerase-based转录。病*救援是通过电穿孔开始培养BHK-MHV-N细胞，然后与病*敏感细胞共培养生产和放大。实验室无需额外获得临床样本。图1-b，从酵母无性系1和2中回收传染性rMHV-GFP。用两个MHV-GFPYAC克隆病*拯救后产生的病*培养上清感染17Cl-1细胞。感染后48小时，用荧光显微镜观察感染细胞的绿色荧光蛋白表达(上图)和荧光显微镜观察感染细胞的绿色荧光蛋白表达(下图)。Mock表示从无病*rna电穿孔的BHK-MHV-N细胞上清接种17Cl-1细胞。图像代表了两个独立的实验。
ImageswereacquiredusinganEVOSFLAuto2ImagingSystemequippedwithacoverslip-correct40xairobjective.(ThermoFisherScientific).
图1-c，MHV-GFP和rMHV-GFP克隆1和2的重复动力学检测。感染L细胞(MOI=0.1)，在感染后指定时间点收集细胞培养上清，用空斑法滴定。数据代表三个独立生物实验的平均值(n=3)。图2，从酵母克隆体1.1、2.2和3.1中挑选出rSARS-CoV-2，从酵母克隆体4.1、5.2和6.2中挑选出rSARS-CoV-2-GFP。10-1,10-2和10-3ml上清或1ml上清从个体拯救实验转移到VeroE6细胞检测斑块(rSARS-CoV-2;或绿色荧光(rSARS-CoV-2-GFP)。模拟:未受感染的细胞。Scalebar=μm.ImageswereacquiredusinganEVOSFLAuto2ImagingSystemequippedwithacoverslip-correct40xairobjective.(ThermoFisherScientific).
结语与展望
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研究者表示：该研究证明了TAR克隆系统的主要优点包括病*基因组可以被分割成至少19个重叠的片段，并以显著的效率重新组装。同时该系统展示了SARS-CoV-2反向遗传系统的全部功能，我们期望快速、健壮和通用的合成基因组学平台可以为大家提供新的见解和研究思路，了解一些新兴RNA病*的分子生物学和发病机制。一切为了抗疫，我们坚信，一定会打赢这场抗疫之战！
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