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望夜
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在高危病原中，#埃博拉病毒#（ebolavirus）以感染致死率高著称。广义的埃博拉病毒是指埃博拉病毒属（Ebolavirus）的成员，自年扎伊尔型埃博拉病毒首次发现以来，该属现包含6种病毒，分别是扎伊尔型（Zairevirus，EBOV）、苏丹型（Sudanvirus，SUDV）、本地布焦型（Bundibugyovirus，BDBV）、泰森林型（TaForestvirus，TAFV）、莱斯顿型（Restonvirus，RESV）及邦巴利型（Bombalivirus，BOMV），其中前三种病毒（EBOV、BDBV、SUDV）的感染会引发严重症状，均曾在非洲出现过致死性感染。迄今为止，共报道19波次的埃博拉疫情，超过3万人感染，总病死率高达70%。即便在今年，刚果和几内亚境内仍出现两次疫情，人感染，病死率约32%。
埃博拉病毒隶属丝状病毒科（Filoviridae），是单股负链RNA病毒，基因组约19kb，共编码七个基因，其中第4个基因GP可翻译产生囊膜蛋白GP和可溶性sGP、ssGP三种形式的蛋白（图1）。GP是埃博拉病毒囊膜表面的唯一糖蛋白，呈同源三聚体的“刺突”状，负责识别并结合宿主细胞表面的粘附性受体。GP蛋白中有一段富含糖基化修饰的黏蛋白样结构域（mucindomain），此外在GP三聚体的顶部还覆盖着一个糖帽子区（glycancap），它们共同保护GP蛋白的融合肽免于过早暴露。一经粘附，病毒粒子即经宿主细胞巨胞饮（Macropinocytosis）进入内吞体（endosome）中。随着内吞体逐渐酸化，其中表达的酸性蛋白酶发挥功能将GP蛋白顶端的糖帽子区切掉，暴露出可结合内吞体膜上融合受体NPC1的GPcl。GPcl与NPC1相互作用，启动病毒囊膜与宿主细胞内吞体膜的融合过程，完成病毒入侵过程。因此，GP蛋白是埃博拉病毒中和抗体的主要靶标。
图1埃博拉病毒的基因组（图片来源见原图标注）
目前在临床试验中，单克隆抗体已可显著延长EBOV型埃博拉病毒感染的生存期。此外，另有一些抗体在非人灵长类试验中显示出逆转EBOV、BDBV或SUDV型病毒疾病进程的作用。至年，FDA已批准两种针对埃博拉病毒感染的单克隆抗体产品，分别是单株抗体ansuvimab-zykl（商品名Ebanga）和抗体组合atoltivimab、maftivimab、odesivimab-ebgn（商品名Inmazeb）。这两款产品均特异性治疗EBOV型埃博拉病毒的感染，但针对BDBV型和SUDV型埃博拉病毒的单抗产品尚存在空白。研发广谱中和EBOV、BDBV和SUDV三型病毒的单克隆抗体受限于GP抗原表位变异度较高的困境，而已报道的埃博拉病毒单抗通常仅针对三种型别中的一种。
尽管困难重重，研究者的努力从未停止。年，GilChuk等报道两株人源单克隆抗体EBOV-和EBOV-，它们均可广谱中和前述三型埃博拉真病毒，均靶向并可结合多种型别病毒来源的GP蛋白，而且两株抗体的表位不存在重叠（EBOV-靶向GP蛋白的基部区，而EBOV-靶向糖帽子区），在动物实验中两者均可对EBOV型病毒感染起到高效的保护作用。后续研究发现，另外两株类似靶点的抗体EBOV-（靶向GP基部区）和EBOV-（靶向GP糖帽子区）可通过协同作用组成抗体组合（antibodycocktail），保护EBOV攻毒的恒河猴（rhesusmacaque）。
延续这一思路，年10月28日，美国Vanderbilt大学JamesE.Crowe,Jr.教授领衔的团队在Cell杂志发表题为Pan-ebolavirusprotectivetherapybytwomultifunctionalhumanantibodies的研究文章，报道前述两种抗体EBOV-和EBOV-作为抗体组合治疗EBOV、BDBV和SUDV型埃博拉病毒感染的临床前研究结果：发现两者展现出协同的中和效果，可抑制病毒发生逃逸，通过优化Fc区到达优异的体内作用效果，并进一步在非人灵长类中确认该抗体组合对三种病毒感染的保护效果，最后利用高分辨率的复合物结构数据揭示抗体中和作用的分子机制。
作者首先通过对抗体可变区测序获得两株抗体的序列，表达获得重组的IgG1型抗体，测定重组抗体均可有效中和EBOV、BDBV和SUDV三种病毒（重组的抗体对SUDV的Gulu毒株仅存在部分中和活性，因此后续实验中改用表达有Boniface毒株GP蛋白的VSV假病毒测试）。接着，作者检测两株抗体是否存在Fc介导的效应者作用，发现抗体组合可表现出细胞毒活性，抗体的效应者作用尤为突出。此外，作者还测试了单独使用和联合使用抗体时病毒是否出现逃逸突变的情况，发现当单独使用抗体或1:1联合使用两种抗体的组合时，在测试的病毒复制次数（和60）中均未检出突变；单独使用号抗体时，病毒产生的逃逸突变依然可以被号抗体或该抗体组合中和。因此，该抗体组合对病毒的逃逸突变有高抵抗性，且同时具备中和活性和Fc介导的效应者作用。
为确定Fc介导的效应者作用是否在抗体的在体（invivo）保护效果中发挥作用，作者对两株抗体的Fc片段分别进行LALA改造，即在抗体的Fc片段同时引入LA、LA、PG三个突变，报道称它们可以消除鼠源IgG2a和人源IgG1抗体的补体结合能力、Fc-γ受体依赖性、及ADCC作用。通过Fc片段改造与未改造抗体组合对小鼠的保护实验，发现Fc片段的改造确实可以影响抗体的在体效果，当对号抗体进行LALA改造、同时保持号抗体作为野生型IgG1时，可以产生广谱的在体保护作用。
接下来作者将AlexaFluro-荧光标记的号抗体（野生型IgG1）和号抗体（LALA改造型）的梯度稀释液两两组合的方式，利用流式系统测试它们对表面表达有EBOV型GP的Jurkat细胞的结合能力，发现抗体组合确实存在协同作用，每种抗体均可增强另一种抗体的中和效果，且随着抗体浓度提高，增强效果更加明显。作者进一步测试两种抗体对三型VSV/GP假病毒的中和效果，发现呈现剂量依赖性，还测试了两种抗体以不同稀释度组合时对三种假病毒的中和效果。
下面进行非人灵长类的在体效果评估。依然选择LALA改造的号抗体与IgG1型的号抗体的组合，并按经验选定两者按照2:1的比例混合，这是基于如下几个原因：首先，号抗体对SUDV型病毒的中和活性更高；其次，号抗体在小鼠体内实验时保护效果更佳；再次，相较于号抗体，使用号抗体时病毒更不容易出现逃逸突变；最后，在此比例下抗体可发挥出协同效果。作者分别使用恒河猴模型测试抗体组合对EBOV和SUDV病毒的保护效果，用食蟹猴（cynomolgusmonkey）模型测试对BDBV病毒的保护效果，均攻毒致死剂量（PFU）的病毒，按照30mg/kg剂量静脉注射抗体两次，间隔3天（EBOV组在攻毒后第3和6天给药，BDBV组在第6和9天给药，SUDV组在第4和7天给药）。结果全部治疗组均显示对三种病毒的完全保护效果，疾病指数未见波动，血液和生化指标均未显示出现埃博拉病的特征。尽管在第一次抗体注射后，受试动物血中均不同程度检出病毒RNA，噬斑实验也确认病毒的存在，说明所有动物均已被感染；而在第二剂量注射后，受试动物血中不再检出活病毒，至第15天病毒核酸水平全部降至检测线以下。至测试终点（病毒注射后第28天）时，作者还对受试动物的11种免疫豁免组织样品进行病毒检测，全部样品中均未检出活病毒。因此，该抗体组合对已产生病毒血症的三种病毒均有治愈效果，并可清除免疫豁免器官中的病毒，阻止病症的出现。
最后，作者还使用结构生物学手段分析抗体作用的分子机制。由于号抗体的作用机制此前已经获得解析，故本次研究聚焦于号抗体的作用机制。作者获得了和抗体的Fab与不含mucindomain的EBOVGP的复合物，并使用冷冻电镜解析其结构。结构模型显示，抗体主要通过其重链的三段CDR区结合GP蛋白融合肽的基部及GP1的一部分，轻链的三段CDR区也与GP2存在相互作用，抗体和GP的作用界面主要由两者间疏水和静电相互作用形成。测试还发现，号抗体在pH低至5.5甚至4.5时，仍可结合EBOV的GP蛋白，显示出对GP的稳定结合能力。此外，相较于另两种广谱中和抗体ADI-和EBOV-，作者发现尽管与GP1的互作面最小，但号抗体靶向的区段完全保守，包括R和E，这可能是其中和谱更宽、保护效果更佳的原因。
回顾全文，承接此前已报道的抗体发现，作者着重研究两株人源抗体EBOV-和EBOV-对三种临床高危埃博拉病毒型别（EBOV、BDBV和SUDV）的体外中和效果，通过评价Fc介导的效应者在抗体在体治疗效果中的作用确定对Fc区段的改造，利用两者可以协同发挥中和效果确定抗体混合比例；进一步的动物实验显示，该抗体组合可完全保护三种埃博拉病毒对非人灵长类的感染，清除免疫豁免器官中的病毒，有效防止病症的产生，最后利用结构生物手段分析抗体作用的分子机制。本研究为利用结构-功能数据理性开发抗体组合提供一个理想的参考范例。同时，该抗体组合已初步显示出广谱治愈多种埃博拉病毒感染的潜力，期待后续开发进展。
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