北京白癜风医院 https://yyk.39.net/hospital/89ac7_map.html年在东京召开的国际NANBH会议上，正式将一种经血液传播的NANBH病毒命名为丙型肝炎病毒（HCV），HCV引起的肝炎称为丙型肝炎。HCV是第一个用分子克隆方法证实的病原体，不仅是肝炎研究的重大突破，同时也是采用分子生物学手段探索疾病病因的成功范例。年诺贝尔生理学或医学奖便是授予给美国科学家哈维·阿尔特、查尔斯·赖斯以及英国科学家迈克尔·霍顿，以表彰他们在发现丙型肝炎病毒方面所做出的贡献。
其中，检测手段在丙型肝炎病毒的发现以及后续临床诊疗中发挥着重要作用。在临床中，我们如何合理运用HCV血清学检测和基因学检测帮助我们更好诊断丙型肝炎呢？《国际肝病》特此整理并作如下分享。
一
HCV血清学检测
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抗体检测
抗-HCV检测［化学发光免疫分析法（CIA），或者酶免疫法EIA］可用于HCV感染者的初筛。快速诊断测试（RDTs）可用来初步筛查抗-HCV。对于抗体阳性者，应进一步行HCVRNA检测，以确定是否为丙型肝炎。血清抗-HCV滴度越高，HCVRNA检出的可能性越大。一些血液透析和自身免疫性疾病患者可出现抗-HCV假阳性，免疫功能缺陷或合并HIV感染者可出现抗-HCV假阴性，急性丙型肝炎患者可因为抗-HCV检测处于窗口期出现抗-HCV阴性，HCVRNA检测有助于确诊这些患者是否合并感染HCV。
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抗原检测
在缺乏HCVRNA检测条件时，可考虑进行HCV核心抗原检测，用于慢性HCV感染者的实验室诊断。
二
HCV基因学检测
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HCVRNA定量检测
HCVRNA定量检测应采用基于PCR扩增、灵敏度和精确度高并且检测范围广的方法，其检测结果采用IU/ml表示，检测下限低于15IU/ml。HCVRNA定量检测适用于HCV现症感染的确认、抗病毒治疗前基线病毒载量分析、抗病毒治疗过程中及治疗结束后的应答评估。当前HCVRNA定量检测试剂盒国外有COBASAmplicorTMHCVTestv2.0、COBAS-TaqManM及realtimeHCVMasays、LCxMHCV定量分析法、VersantMHCVassays等，一般检测范围在10～10IU/ml。国内也有多种检测HCVRNA的实时荧光定量PCR试剂获得国家药品监督管理局正式批准。
在应用干扰素治疗方案时，高灵敏度的HCVRNA检测试剂有助于更准确地鉴定快速病毒学应答及早期病毒学应答，从而为个性化决定疗程提供更可靠的依据。在应用直接作用抗病毒药物（DAA）的治疗方案中，绝大多数患者在短期治疗后，HCVRNA迅速降低甚至低于检测水平。在这种情况下，高灵敏度的HCVRNA检测试剂的临床预测价值（如预测治疗失败）如何，值得进一步研究。
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HCV基因分型
HCV基因分型方法包括分子生物学和血清学两大类。HCV血清学分型技术是根据HCV某些区域表达抗原具有与基因型对应的型别差异，合成或表达型特异性多肽作为包被抗原，对HCV血清抗体进行分型检测，可以区分基因型，但不能区分亚型。分子生物学方法主要包括以下几种。
（1）测序法：通过PCR扩增有代表性的基因片段（如5-UTR、C-E1和NS5B），再进行核苷酸序列测定，是HCV基因分型的“金标准”。
（2）型特异性引物扩增：根据不同HCV基因型在某一区段（主要是保守区）序列的差异，设计一系列型特异性引物，不同HCV基因型可扩增出长度不同的片段，并以此分型。
（3）型特异性探针杂交法：通过将生物素或荧光素标记型特异性探针固相化在膜或芯片上，与实时定量PCR扩增的病毒产物进行杂交后，经扫描判读出HCV基因型。用于该分型方法的区段是5-UTR及核心区。
（4）基因芯片法：将许多特定的寡核苷酸片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一个探针上的荧光信号进行分析比较，从而迅速得出需要的信息。
（5）限制性片段长度多态性分析法：利用限制性酶识别RT-PCR扩增的特定区域（5-UTR、CE1和NS5B）的型特异的切割位点，将其分解为长短不同的若干片段以确定分型，该方法常用酶为HaeI、RsaI、MvaI、HinfI及ScrfI，利用这些酶可区分出6个基因型。
（6）遗传发育关系进化树分析法：该分析法是在核苷酸序列分析的基础上建立的，对一定区域内的样本测序结束后，可将序列相互比较，分析样本间序列的进化距离，画出该区域内HCV流行的关系进化树，观察HCV在区域内的分子流行情况及特点；也可将样本序列与全球已发表的该区段序列比较，分析与其他序列的差异。
（7）其他：特异性引物错配延伸法、荧光共振能量转移探针的解离曲线分析法和异源分子迁移率法等。
HCV基因分型对指导抗病毒治疗特别是干扰素治疗具有非常重要的意义，可根据基因分型进行个体化治疗。例如，基因1型需要聚乙二醇干扰素联合标准剂量利巴韦林治疗48周，而2型和3型以低剂量的利巴韦林治疗24周即可，基因6型24周治疗也可获得较好的持续应答。在DAA治疗方案中，HCV基因型检测对于选择治疗方案仍有一定的意义，尤其是区分1a和1b型对于某些药物选择很重要。
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HCV耐药相关基因检测
DAA单药治疗容易导致耐药的发生，目前检测耐药突变的方法包括基因序列分析法（如直接测序法、新一代深度测序法等）和表型分析方法（如检测抑制病毒复制50%或90%所需的药物浓度EC50或EC90）。由于HCV以准种形式存在，当前新一代深度测序法应用较多。当前已确认的耐药突变位点主要有：①NS3/4A靶点相关，如V36M、T54A、Q80K、RK、AT和DV；②NS5A靶点相关，如M28T、Q30E/H/R、L31M、H58D和Y93H/N；③NS5B靶点相关，如ST、CNHF、MT、AV、PL/S和SG等。
但是，目前国内外指南推荐的主流治疗方案（包括泛基因型方案和基因型特异性方案）的耐药率很低，故一般不再推荐在治疗前进行耐药基因检测。
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宿主IL28B基因分型
发现IL28B与丙型肝炎相关的GWAS研究多采用高通量SNP检测方法。但对临床实验室而言，仅需检测特定的宿主基因型如IL28B和ITPA，故传统测序法或第二代焦磷酸测序法、RFLP、实时PCR、DNA微阵列芯片等即可满足要求。在美国已有商品化的试剂盒检测IL28B的基因型，我国也有类似的商品化试剂盒已申请专利。目前常用的IL28B和ITPA基因分型方法包括DNA直接测序、TaqManSNP探针法等。
在干扰素治疗方案中宿主IL28B基因的多态性与持续病毒学应答相关，特别是在感染了基因1型或4型病毒的患者中，相关性更明显。IL28BrsCC基因型、rsTT基因型及rsAA基因型与HCV感染的自发清除和干扰素治疗应答良好具有相关性。但在DAA治疗方案中，宿主IL28B基因的多态性对治疗应答没有预测价值。
参考文献：（上下滑动
